qPCR Probes -
Für Sondenbasierte qPCR Assays

Die klassischen Dual Labeled Probes sind Hydrolysesonden, die entwickelt wurden, um die Spezifität der quantitativen PCR zu erhöhen.

Dual Labeled Probes, die in quantitativen Echtzeit-PCR-Systemen verwendet werden, nutzen die 5'-> 3'-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase aus. Sie bestehen aus einem Fluorophor am 5'-Ende und einem 3'-Quencher, der zwischen den PCR-Primer bindet. 

Während der Extensionsphase der PCR spaltet die 5'–3' Exonukleaseaktivität der Taq DNA-Polymerase den Fluoreszenzreporter von der Sonde ab. Die Menge an freien Reportermolekülen nimmt entsprechend der Anzahl der PCR-Zyklen zu. Das Fluoreszenzsignal der freien Reportermoleküle wird in Echtzeit gemessen und ermöglicht somit die Quantifizierung der Zielsequenz.

Erhältliche Farbstoff - Quencher Kombinationen:

Produktspezifikationen:

• Synthesemaßstäbe: 0,01 - 1,0 µmol
• Sequenzlänge: 5 - 40 Basen (Wobbles, nicht equimolar, möglich)
• HPLC-Reinigung inklusive
• Produktionszeit: 3 - 5 Arbeitstage (1,0 µmol dauert länger)

MGB-Sonden von Eurofins Genomics stabilisieren die Sonden-Target-Hybridisierung und erhöhen die Schmelztemperatur.

Eurofins Genomics MGB-Sonden enthalten einen 5'-Fluoreszenzfarbstoff und den 3'-Eclipse-Quencher (EQ), der an das Minor-Groove-Binder (MGB)-Molekül gebunden ist.

Sonden, die ein MGB-Molekül enthalten, bilden eine besonders stabile Verbindung, wodurch sich die Schmelztemperatur (T_m) signifikant erhöht. Somit ist es möglich kürzere Sonden in der Real-Time PCR zu verwenden (bis zu 13 Basen) als mit herkömmlichen Dual Labeled Probes.

MGB Probes für Genexpressionsanalysen & SNP Genotypisierung

Die Doppelstang-DNA wird denaturiert indem die Temperatur erhöht wird. Zu diesem Zeitpunkt ist der Farbstoff der Sonde von dem MGB-Eclipse Quencher abgedunkelt.

Figure 1: Gene Expression analysis (click to enlarge)

Indem die Temperatur verringert wird, annealen die PCR Primer und die MGB-Sonde an ihre spezifische Zielsequenz. Eine allelische Diskriminierung wird durch ein gezieltes Annealing der MGB-Sonde erreicht (SNP Genotypisierung - Abbildung 2).

Die Taq Polymerase synthetisiert einen komplementäre DNA-Strang, indem sie die PCR Primer als Leitfaden nutzt. Sobald die Polymerase die MGB-Sonde erreicht, spaltet ihre 5' Nuklease Aktivität die Sonde und trennt den Farbstoff vom Quencher.

Figure 2: Allelic discrimination by selective annealing (click to enlarge)

Erhältliche Farbstoff - Quencher Kombinationen:

Produktspezifikationen:

• Erhältlich in den Mengen 5 nmol, 20 nmol und 40 nmol
• Sequenzlänge: 5 - 40 Basen
• HPLC Reinigung inklusive
• Produktionszeit: 3 - 5 Werktage

LocNA Probes ermöglichen das optimale Design hochspezifischer und kürzerer Sonden.

LocNA-Sonden enthalten Locked Nucleic Acid (LNA)-Basen, die die Stabilität und Leistung von qPCR-Assays verbessern. Diese modifizierten Basen bieten eine 2'-O, 4'-C-Methylenbrücke, die das 2'-Sauerstoff effektiv an das 4'-Kohlenstoff 'verriegelt'. LocNA-Sonden sind die optimale Wahl bei der Gestaltung hochspezifischer, kürzerer Sonden mit herausfordernden Zielsequenzen.

Erhältliche Farbstoff - Quencher Kombinationen:

Produktspezifikationen:

• Die durchschnittliche Ausbeute beträgt 2 OD bzw. 15 nmol
• Sequenzlänge von 10 - 40 Basen
• Bis zu 15 LocNA Basen pro Sonde sind möglich
• Am 5'- und 3'-Ende sind nur DNA-Basen erlaubt
• HPLC-Reinigung inklusive
• Lieferung erfolgt trocken oder flüssig in gewählter Konzentration
• Produktionszeit beträgt 5 Arbeitstage

Molecular Beacons sind Haarnadel-förmige dual-markierte Hybridisierungssonden.

Die Sequenz dieser Sonden ist so definiert, dass sie eine sogenannte Hairpin-Struktur ausbilden, in der Reporter und Quencher sehr nah beieinander liegen. Diese Sonde ist so konzipiert, dass sie zwischen den spezifischen PCR Primern bindet.

In der Annealing-Phase der PCR bindet die Sonde an ihre Zielsequenz. Die nadelöhrartige Sequenzstruktur öffnet sich und trennt den Fluoreszenzreporter vom Quencher. Dadurch steigt die Fluoreszenz der Probe. Die in Echtzeit gemessene Fluoreszenz ist proportional zur Menge der Zielsequenz und ermöglicht so deren Quantifizierung.

Molecular Beacons sind über die Dual Labeled Probes Bestellseite erhältlich.

LightCycler Probes oder FRET Probes sind Hybridisierungssonden für das Fluoreszenz-Resonanzen-Energie-Transfer (FRET) Verfahren.

Sie bestehen aus einem Paar von Oligonukleotiden (Donor und Akzeptor), von denen jedes mit einem anderen fluoreszierenden Farbstoff markiert ist.

Der Donor und der Akzeptor sind so konzipiert, dass sie an benachbarte Regionen in unmittelbarer Nähe zueinander auf der Ziel-DNA hybridisieren. Die Akzeptor-Sonde ist am 5'-Ende mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, während die Donor-Sonde am 3'-Ende mit Fluorescein markiert ist. Die Interaktion der beiden Farbstoffe kann nur erfolgen, wenn beide an ihr Ziel gebunden sind.

Während des Fluoreszenz-Resonanzenergietransfers wird das fluoreszierende Donor-Molekül von einer externen Lichtquelle angeregt und überträgt seine Energie auf das Acceptor-Fluorophor. Der angeregte Acceptor emittiert Licht in einer anderen (längeren) Wellenlänge, die detektiert und gemessen werden kann.

Acceptor

Donor

Bitte bestellen Sie diese Sonden als kundenspezifische DNA-Oligos >> hier!

BHQ1 [BHQ1] 480-580 nm

BHQ1 ist ein sehr effizienter Dark Quencher für Dual Labeled Probes, Molecular Beacons und FRET-Sonden mit einer ausgezeichneten spektralen Löschung der Emission aller Farbstoffe im grünen bis dunkel-gelben Emissionsbereich.

BHQ2 [BHQ2] 520-650 nm

BHQ2 ist ein weiterer Black Hole Quencher von Biosearch Technologies, Inc. in unserem Portfolio. BHQ2 ist ein höchst effizienter Dark Quencher für Dual Labeled Probes, Molecular Beacons und FRET-Sonden mit Farbstoffen im dunkel-grünen bis orangefarbigen Emissionsbereich.

BBQ 650 [BBQ650] 550-750 nm

Der BlackBerry Quencher 650 ist ein hervorragender Quencher für Dual Labeled Probes, Molecular Beacons und FRET-Sonden mit langwelligen Fluorophoren wie Cy5, Cy5.5 und anderen Farbstoffen im roten bis infraroten Emissionsbereich.