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Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen

Die passende Antwort auf häufig gestellte Fragen

Finden Sie erklärende Informationen zu unseren Produkten und Dienstleistungen, indem Sie auf die folgenden Links klicken.

Next Generation Sequencing

Probenvorbereitung

Was sind die Richtlinien für die Probenvorbereitung?

Einen Überblick über alle unsere Richtlinien zur Probenvorbereitung finden Sie hier >>

Kann ich meine Proben in 96-well Platte oder PCR Strips schicken?

Bitte senden Sie Ihre Proben in barcode-beschrifteten 1,5 ml Safe-Lock-Tubes; oder bei > 48 Proben in einer "Eppendorf twin.tec PCR Plate 96, full-skirted", wobei die Positionen G12 und H12 leer bleiben müssen.

Führt Eurofins Genomics eine Qualitätskontrolle (QC) meiner Proben vor der Bibliotheksvorbereitung durch?

Die Eingangskontrolle für Ihre Proben variiert von Produkt zu Produkt. Für RNA-Seq Projekte, zum Beispiel, wird nicht nur die Menge sondern auch die Qualität der RNA kontrolliert.

Was soll ich tun, wenn meine Probe die Eingangs-QC nicht besteht?

Wenn die Menge, Konzentration oder Qualität des Ausgangsmaterials nicht den Anforderungen für die weitere Verarbeitung entspricht, werden wir Sie kontaktieren, um das weitere Vorgehen zu besprechen. Falls möglich, wird Eurofins Genomics zusätzliche Vorverarbeitungsschritte empfehlen, um die Probenqualität zu optimieren.

Bestellung und Probenversand

Wie kann ich den gewünschten Service bestellen?

Bitte wählen Sie den gewünschten Service aus (zum Beispiel im Schnellbestell-Menü oben auf der Seite) und folgen Sie den Anweisungen.

Abhängig vom ausgewählten Produkt müssen Sie möglicherweise zunächst ein Angebot anfordern.

Sobald Ihr Angebot verfügbar ist, werden Sie benachrichtigt und können es in Ihrem Konto akzeptieren (navigieren Sie dazu bitte zu „Konto“ -> „Angebote“).

Im Bestellprozess werden Sie aufgefordert, Ihre Proben über unser Sample Submission Sheet hochzuladen. Die Möglichkeit, das Formular herunterzuladen, finden Sie direkt neben der Upload-Schaltfläche (laden Sie das Formular bitte immer hier herunter, da es je nach angebotenem Produkt unterschiedlich sein kann). Dieses Formular erfordert, dass Sie uns weitere Informationen zu Ihren Proben bereitstellen und Eurofins NGS Barcode-Etiketten Ihren Proben zuweisen.

 

 

Wie erhalte ich Eurofins NGS Barcode-Etiketten?

Unsere Eurofins NGS Barcode-Etiketten können (kostenlos) auf unserer Website bestellt werden.

Pfad: „Bestellmenü“ -> „Next Generation Sequencing“ -> „Zusätzliche Services“ -> „NGS Barcodes & UPS-Etiketten“

Nach ein paar Tagen erhalten Sie Ihre Etiketten. Bitte kleben Sie diese entsprechend der Zuordnung, die Sie im **Sample Submission Sheet** vorgenommen haben, auf Ihre Tubes. Bitte beachten Sie, dass wir nur Proben in unserem Labor akzeptieren können, die mit unseren Eurofins NGS Barcode-Etiketten gekennzeichnet sind.

Eine Liste Ihrer Eurofins NGS Barcode-Etiketten finden Sie auch unter „Konto“ -> „NGS Barcodes & Coupons“ -> „NGS Barcodes“.

 

 

Wie kann ich meine Proben zu Eurofins schicken?

Bitte beachten Sie, dass Eurofins Genomics über mehrere Standorte in Deutschland verfügt. Stellen Sie daher sicher, dass Sie Ihre Proben an den korrekten Standort senden, wie es in Ihrem Angebot oder von Ihrem Vertriebsmitarbeiter angegeben wurde.

Falls Sie UPS-Versandetiketten benötigen, können Sie diese auf unserer Website bestellen:

Pfad: „Bestellmenü“ -> „Next Generation Sequencing“ -> „Zusätzliche Services“ -> „NGS Barcodes & UPS-Etiketten“

Das UPS-Etikett wird Ihnen innerhalb eines oder zwei Tagen per E-Mail zugesendet.

Standardadresse (nicht für S2-Materialien und nicht für ONT-Lite-Service):

Eurofins Genomics Europe Pharma and Diagnostics Products & Services
Sanger/PCR GmbH
Jakob-Stadler-Platz 7
78467 Konstanz
Deutschland

Wie kann ich den Status meiner Bestellung verfolgen?

Sie können den Status Ihrer Bestellung in Ihrem Ecom Account nachverfolgen.

Bitte navigieren Sie zu ihrem "Account" -> “Bestellungen” -> “Meine Bestellungen”.

Hier sehen Sie alle Ihre Bestellungen aufgelistet.

Für detailliertere Informationen zu einer Bestellung klicken Sie bitte auf das "Statusverfolgungs"-Symbol (siehe unten). Es führt Sie zu unserer Status-Seite für diese spezielle Bestellung. Hier finden Sie dann alle Details zu jeder Probe.

 

 

Ergebnisse

Wie bekomme ich Zugang zu meinen Daten?

Melden Sie sich mit Ihrer E-Mail-Adresse und Ihrem Passwort in Ihrem Eurofins-Konto an und klicken Sie auf „Meine Bestellungen“, dann auf das Symbol neben Ihrer Bestell-ID (siehe Screenshot unten).

Die Dateien finden Sie im Abschnitt „DOKUMENTE & DATEIEN HERUNTERLADEN“.

Falls Sie komprimierte Dateien erhalten haben, empfehlen wir **7-ZIP** (https://www.7-zip.org/), um diese zu entpacken. Dateien werden 8 Wochen nach der Bereitstellung von unserem Server gelöscht.

Alternativ können Sie auf Ihre Daten über unseren FTP-Server unter **ngs-ftp.eurofinsgenomics.eu** zugreifen, indem Sie den Benutzernamen (das „ftp-“ gehört zum Benutzernamen) und das Passwort verwenden, das Sie per E-Mail erhalten, sobald Ihre ersten Daten bereitgestellt werden. Falls Sie Ihr Passwort vergessen haben, geben Sie **ngs-ftp.eurofinsgenomics.eu** in Ihren Browser ein und wählen Sie die Option „Passwort vergessen?“.

Sollten Sie auf Probleme stoßen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

 

 

 

 

 

Sind meine Daten bei Eurofins sicher?

Wir legen großen Wert auf Datensicherheit und tun alles, um Ihre Daten privat und geschützt zu halten. Unsere Datenübertragungsmethoden sind sicher; wenn Sie jedoch eine alternative Zustellmethode bevorzugen, erfüllen wir Ihren Wunsch gerne.

Was wenn meine Ergebnisse nicht meinen Erwartungen entsprechen?

Wenn Sie glauben, dass ein Verarbeitungsfehler aufgetreten sein könnte, kontaktieren Sie uns bitte, und wir werden den Fall individuell prüfen.

Welche Dateien und Datei-Typen werde ich erhalten?

Je nach Produkt und abhängig davon, ob Sie Ihren Service mit oder ohne zusätzliche bioinformatische Analyse bestellt haben, können die gelieferten Daten variieren.

Sie erhalten immer FASTQ-Dateien und einen HTML-Bericht. Die zusätzlichen Datentypen können Sie auf der jeweiligen Bestellseite des gewünschten Services einsehen.

Hier finden Sie eine Übersicht über alle angebotenen Services >>

 

Welche Datenanalyse bieten Sie an?

Dies hängt vom ausgewählten Service ab und davon, ob Sie den Service mit oder ohne bioinformatische Analyse bestellen.

Alle Details zur Bioinformatik und die Dateien, die Sie erhalten, können Sie auf der Inhaltsseite des jeweiligen Services einsehen.

Eine Übersicht über alle NGS-Services, die wir anbieten, finden Sie hier.

INVIEW Exome

Allgemeine Fragen zur Probenübermittlung, Bestellung, zum Probenversand und zu Ergebnissen finden Sie hier:

Allgemeine FAQs im Bereich Next Generation Sequencing >>

Was für eine Abdeckung soll ich verwenden?

Zum Auffinden von SNPs in heterozygoten Organismen empfehlen wir mindestens eine 30x-Abdeckung. Eine höhere Abdeckung erhöht die Zuverlässigkeit der SNP-Auffindung. Eine zuverlässige Aufdeckung von genetischen Varianten in inhomogenen Proben wie etwa aus normalen Zellen und Tumorzellen extrahierter DNA erfordert eine höhere Gesamtabdeckung. Die zum Erreichen einer bestimmten Abdeckung auf der interessierenden DNA benötigte Datenmenge ist vom Verhältnis von normaler DNA zu Tumor-DNA abhängig. Bitte beachten Sie, dass auf Grund der unterschiedlichen Effizienz der für die Anreicherung verwendeten Baits die Zielregionen nicht gleichmäßig abgedeckt werden (siehe unten). 

Wie handhaben Sie PCR-Duplikate?

Die Häufigkeit von PCR-Duplikaten ist direkt mit Qualität und Menge des Ausgangsmaterials korreliert. Die Library-Erstellung mit weniger als der empfohlenen Menge an DNA erfordert zusätzliche PCR-Zyklen, damit genügend Material zum Beladen des Sequenziergeräts erzeugt wird. Die Häufigkeit von PCR-Duplikaten hängt daher von der Probe ab und kann von GATC Biotech nicht beeinflusst werden. 
Duplikate sind aus der Berechnung der durchschnittlichen zielgerichteten Abdeckung nicht ausgeschlossen. Gemäß unserer Erfahrung mit der Sequenzierung humaner Proben erzielen wir für qualitativ hochwertige DNA in der Regel PCR-Duplikatraten von ca. 5 %. 
 
Wenn weitere bioinformatische Analysen (z. B. SNP-Identifizierung) in Auftrag gegeben werden, dann wird nur eine Kopie des doppelten Read-Paares im Alignment behalten. Der Rest wird zur Vermeidung eines Bias aus der weiteren Analyse ausgenommen.

Was für ein Ausgangsmaterial soll ich schicken? In welchen Mengen?

Für optimale Ergebnisse benötigen wir mindestens 100 ng aufgereinigte RNA-freie Doppelstrang-DNA mit hohem Molekulargewicht (Konzentration ≥ 1 ng/µl; OD 260/280 ≥ 1,8; OD 260/230 ≥ 2,0). Für DNA von FFPE-Proben benötigen wir mindestens 200 ng DNA. 

Eine Kontamination durch DNA von anderen Spezies (> 3 %, insbesondere von nah verwandten Spezies) könnte die Anreicherung der humanen DNA stören und reduziert zudem die Gesamtmenge an humaner DNA in der gesendeten Probe. Akzeptiert wird in der Regel amplifizierte Gesamtgenom (WGA)-DNA oder DNA aus archiviertem Gewebe, wie beispielsweise Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete (FFPE) Proben. Wenden Sie sich an uns, wenn Sie Einzelheiten wissen möchten. 

Was meinen Sie mit überlappenden Reads?

Die Fragmentierung genomischer DNA nach dem Agilent SureSelectXT-Protokoll und die darauffolgende Weiterverarbeitung ergeben eine Normalverteilung von DNA-Fragmenten mit unterschiedlichen Längen. Ein kleiner Prozentsatz der entstandenen Library-Fragmente haben eine Insert-Größe von weniger als 250 bp. Die Sequenzierung dieser Library-Fragmente mit Paired-End-Reads von 150 bp erzeugt teilweise überlappende Reads, welche die gleichen Basen abdecken; somit entsteht eine künstliche Verdoppelung der Abdeckung an diesen Stellen. Zur Gewährleistung präziser Analysen werden diese Basen aus weiteren Analysen (z. B. Erkennung von Einzelnukleotid-Varianten und Insertionen/Deletionen) ausgeschlossen. Darüber hinaus werden die Protokolle bei Eurofins Genomics fortlaufend mit dem Ziel optimiert, die Anzahl an überlappenden Basen auf ein Minimum zu reduzieren.

Wie sieht die Qualität der Daten aus?

Bei der Sequenzierung von humanen Proben im Paired-End-Modus (150 bp) erzielt Eurofins Genomics in der Regel über 80 % Basecalls mit einem Qualitätswert von mehr als Q30 (> 99,9 % Genauigkeit). 

Garantieren Sie einen bestimmten zielgenauen Output?

Für Proben, die die erste Qualitätskontrolle bei Eurofins Genomics erfolgreich bestanden haben, garantieren wir Ihnen den Ziel-Output, den Sie bestellt haben. Die durchschnittliche zielgenaue Abdeckung wird berechnet als Summe der kartierten Basen in jeder Zielposition dividiert durch die Anzahl der Basen in der Zielregion (Zielbasen / Größe der Zielregion).

Welche Gene werden angereichert?

Die Zielregion entspricht den Bait-Koordinaten des SureSelectHuman All Exon V6 Kits von Agilent: ca. 60 Mbp der exonischen Basen (> 93 % der Ziele werden mit > 20x, 90 % der Gene werden vollständig abgedeckt – alle Exons – 10 % der Gene werden teilweise abgedeckt).

Werden alle Gene bei 30x abgedeckt?

Auf Grund der unterschiedlichen Effizienz der zur Anreicherung verwendeten Baits (z. B. GC/AT-Gehalt) werden Zielregionen unterschiedlich abgedeckt und die Reichweite und Einheitlichkeit der Abdeckung schwanken innerhalb der Zielregion. Eurofins Genomics wendet das neueste Human All Exon Kit-Design (V6) von Agilent an, das verbesserte Design-Algorithmen aufweist und somit schwierige Regionen besser erfassen und eine hervorragende Einheitlichkeit der Abdeckung bieten kann.

INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling

Allgemeine Fragen zur Probenübermittlung, Bestellung, zum Probenversand und zu Ergebnissen finden Sie hier:

Allgemeine FAQs im Bereich Next Generation Sequencing >>

Welche Arten von Proben können mit INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling verarbeitet werden?

Für das INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling akzeptieren wir frisches Blut (muss in BCT-Röhrchen mit einem stabilisierenden, für die cfDNA-Isolation bestimmten Puffer zur Verfügung gestellt werden) oder alternativ frische oder aufbewahrte Plasmaproben, sowie bereits isolierte zellfreie DNA. Weiteres entnehmen Sie bitte unserem Informationsblatt zur Probenvorbereitung. Die cfDNA wird aus Blutplasma extrahiert. 
Bei Ausgangsmaterial wie DNA, die aus FFPE-Proben und frisch eingefrorenen Gewebeproben isoliert wurde, sehen Sie sich bitte unser Produkt für die Charakterisierung fester Tumorproben an: INVIEW Oncoprofiling.

Wie erfolgt die Anreicherung der gewünschten Genabschnitte?

Die interessierenden Gene werden unter Verwendung firmeneigener Eurofins-Protokolle mit der hochmodernen Hybridisierungstechnologie SureSelect von Agilent angereichert. Das Zielregionen-Anreicherungssystem erfasst genomische Zielregionen mit Hilfe von langen 120 nt-RNA-Baits. Mit Hilfe der auf Hybridisierung basierenden Strategie können PCR-Duplikationen im Assay leicht abgezogen werden. Das Eurofins-eigene Protokoll ermöglicht die Erstellung von hochkomplexen Bibliotheken, eine tiefgreifende Abdeckung der interessierenden Regionen sowie eine verbesserte Einheitlichkeit der Sequenz. Im Anschluss an die Anreicherung der Zielregionen wird eine Next Generation Sequenzierung der Bibliothek durchgeführt.

Welche Arten von Mutationen können mit INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling erkannt werden?

Das Produkt sucht die Exons von etwa 728 Genomregionen ab, die an der Entstehung von Krebs beteiligt sind. Dadurch wird eine extrem hohe Anzahl von möglichen Mutationen abgedeckt und analysiert. Zu den erkannten genomischen Aberrationen zählen SNPs, InDels, und CNVs.

Wie sensitiv ist das Produkt?

Die Erkennung von SNP und InDel hat eine technische Empfindlichkeit von bis zu 1 %.

Welche Art von Qualitätskontrollen führen Sie durch?

Die Qualität und Quantität jeder Probe werden bei Eingang der Probe oder nach der DNA-Extraktion bestimmt. Weitere Qualitätskontrollen erfolgen bei verschiedenen Schritten des Prozesses.

Welches Produkt soll ich wählen – INVIEW Liquid Biopsy Oncoexome oder INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling?

Alle drei Tests können bei Flüssigbiopsieproben (cfDNA) zum Einsatz kommen. Die drei Produkte dienen als leistungsstarkes, nichtinvasives Tool für die Krebsprofilierung.

INVIEW Liquid Biopsy Oncoexome ist der erste kommerziell erhältliche Service für die Gesamtexom-Sequenzierung (WES) von cfDNA. Mit diesem Service erhalten Sie ein umfassendes Profil aller Mutationen in den proteinkodierenden Bereichen des Exoms. Dieses Produkt eignet sich für einen eingehenden Blick auf das Exom eines Krebspatienten in Fällen, in denen nur begrenzte Informationen über klinisch relevante Mutationen zur Verfügung stehen.

INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling ist ein umfassendes NGS-Krebspanel zur Charakterisierung wichtiger tumorspezifischer Mutationen, die bei fast allen Krebsarten eine Rolle spielen. Mittels SureSelect von Agilent und einem optimierten GATC-Protokoll zielt dieses Panel auf 600 bekannte Krebsgene einschließlich Tumorsuppressoren, Hotspots und Resistenz-Markern. Das Panel verfügt über eine optimierte Sequenzabdeckung und Gleichförmigkeit mit einer Sensitivität von 1 %.


Kann ich INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling für diagnostische Zwecke verwenden?

Das Produkt steht nur für Forschungszwecke zur Verfügung. Alle Proben werden in Erfüllung der ISO 17025:2005-Akkreditierung verarbeitet.

Wo liegen die Grenzen der CNV-Analyse?

Auch bei Einreichung von Kontrollproben (Plasmaproben von mindestens sieben andere Patienten/Personen) kann die Methode der CNV-Analyse Einschränkungen unterliegen. Sensitivität und Spezifität des Assays hängen vom Ausmaß der vorhandenen CNV sowie vom Tumoranteil ab.

Werden alle Veränderungen der Kopienzahl in meiner Probe erkannt?

Die Heterogenität eines Tumors kann eine korrekte Identifizierung aller relevanten Kopienzahlvariationen in einer gegebenen Plasmaprobe erschweren. Darüber hinaus könnte eine übermäßige Verunreinigung mit DNA aus normalen Zellen zu Unterschieden bezüglich der Abdeckung führen, die selbst bei den hochsensitiven Methoden von Eurofins Genomics zu klein sind, um nachgewiesen zu werden.

Wie schnell soll ich die Probe nach der Blutentnahme versenden?

Wie empfehlen, dass die Blutprobe innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme an Eurofins Genomics versandt wird. Die Probe muss in Blutentnahmeröhrchen von BCT Streck gelagert werden. Lagerung und Auslieferung von Blutproben müssen bei Raumtemperatur erfolgen. Plasmaproben müssen auf Trockeneis verschickt werden.

INVIEW Oncoprofiling

Allgemeine Fragen zur Probenübermittlung, Bestellung, zum Probenversand und zu Ergebnissen finden Sie hier:

Allgemeine FAQs im Bereich Next Generation Sequencing >>

Welche Arten von Proben können mit INVIEW Oncoprofiling (728 genes) verarbeitet werden?

Für INVIEW Oncoprofiling (728 genes) akzeptieren wir frisch eingefrorene Proben sowie FFPE-Proben (Gewebe und Blut) und genomische DNA.
Für die Flüssigbiopsie-Analyse von aus Blutplasma isolierter zellfreier DNA (cfDNA) sehen Sie sich bitte unser Produkt INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling (728 genes) an.

Wie erfolgt die Anreicherung der gewünschten Genabschnitte?

Die interessierenden Gene werden unter Verwendung firmeneigener Eurofins-Protokolle angereichert. Die Anreicherung der Zielregionen übertrifft die Ergebnisse, die auf der üblichen PCR-basierten Anreicherung erfolgen, dank der gleichmäßigen Abdeckung aller Exone der verschiedenen Gene. Die bewährte Methode zur Anreicherung von Zielregionen wurde von Eurofins optimiert: Mit ihr können hochkomplexe Bibliotheken aus geringsten DNA- Konzentrationen entwickelt werden und sie ergibt eine tiefgreifende und einheitliche Abdeckung. Im Anschluss an die Erfassung der Zielregionen wird eine Next Generation Sequenzierung der Bibliothek durchgeführt.

Welche Arten von Mutationen sind mit INVIEW Oncoprofiling (728 genes) nachweisbar?

Der Service deckt die gesamten Exons von etwa 600 krebsrelevanten Genomregionen vollständig ab, einschließlich proteinkodierender Gene, ausgewählter Promotorregionen, miRNAs, und extra-exonische Varianten. Neben SNPs und InDels kann das Produkt auch CNVs erkennen.

Wie wird der TMB (tumor mutational burden) berechnet?

  • TMB is definiert als die Anzahl der somatischen, kodierenden, Basenaustausch- und InDel-Mutationen pro Megabase des kontrollierten Genoms.
    Alle Basenaustauschmutationen und InDels in der kodierenden Region der Zielgene, inklusive der gleichbedeutenden Mutationen, werden zu Beginn gezählt. Anschließend werden wie unten beschrieben verschiedene Filter angewendet
  • Die folgenden Mutationen werden bei der TMB Berechnung in silico ausgeschlossen:
    • bekannte somatische Mutationen in COSMIC und ClinVar
    • Mutationen mit geringer statistischer Sicherheit
    • Bekannte Keimbahnvarianten aus der ExAC (gnomAD) Datenbank
    • Mutationen die mittels dem Somatisch-Keimbahn-Zgyotie Algorithmus als somatisch eingestuft werden
    • Mutationen in Tumor-Suppressor Genen aufgrund der INVIEW Oncopanel All-in-One Ausrichtung auf Krebsmutationen, die Auswirkungen haben und dem möglichen Bias des Panel-Designs
  • Um den TMB pro Megabase zu berechnen wird die Gesamtzahl der gefundenen Mutationen anhand der Größe kodierenden Region in der Zielregion (in Megabasen) normalisiert (Mutationen pro Megabase, mut/Mb). Aufgrund der fehlenden Standardisierung in der TMB Quantifizierung können wir 3 Werte zur Verfügung stellen
    • Nicht-gleichbedeutende Mutationen
    • Nicht-gleichbedeutende Mutationen und zusätzlich InDels
    • Inklusive aller Mutationen

Wie gut ist die TMB Bestimmung mit einem speziellen Panel - wie demINVIEW Oncoprofiling (728 genes) - im Vergleich zu "Whole-Exome" Sequenzierung (WES)?

Der Goldstandard für die TMB Bestimmung ist klar die "Whole-Exome" Sequenzierung (WES). Spezialisierte Panel wie das INVIEW Oncoprofiling wurde aber in aufwändigen Studien auf die Verwendbarkeit für die TMB Bestimmung untersucht, da die Sequenzierkosten deutlich güngstiger und die Sensitivität deutlich höher ist.

Neueste Ergebnisse zeigen, dass Panels mit einer Größe von > 1.5 Mbp ausreichend geeignet sind um den TMB zu Bestimmung eine eine starken Übereinstimmung zu WES (Buchhalter et al. 2019, Int J Cancer 144:848–858).

Darüber hinaus liefert das INVIEW Oncoprofiling mit seiner Größe von 3 Mbp eine viel genauere TMB Bestimmung als kleinere Panels.

Wie sensitiv ist das Produkt?

Die Erkennung von SNP und InDel hat eine technische Empfindlichkeit von bis zu 1 %.

Welche Art von Qualitätskontrollen führen Sie durch?

Die Qualität und Quantität jeder Probe werden bei Eingang der Probe oder nach der DNA-Extraktion bestimmt. Weitere Qualitätskontrollen erfolgen bei verschiedenen Schritten des Prozesses.

Was ist der Unterschied zwischen INVIEW Oncoprofiling (728 genes) und INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling (728 genes)?

Beide Tests bieten Variantenerkennung für Krebserkrankungen auf Basis eines validierten Onkologie-Panels. Die abgesuchten Gene und Genomveränderungen des Panels sind gleich. Ebenso basieren die verwendeten Techniken bei beiden Produkten auf Hybridisierung zur Anreicherung definierter Genabschnitte sowie auf Next Generation Sequenzierung.
Der Unterschied zwischen den beiden Produkten besteht in deren Ausgangsmaterial. INVIEW Oncoprofiling (728 genes) wird auf herkömmliches Ausgangsmaterial wie z. B. frisch eingefrorene und FFPE-Gewebeproben angewandt, während mit INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling (728 genes) aus Blutplasmaproben extrahierte cfDNA analysiert wird.

Kann ich die Ergebnisse zwischen INVIEW Oncoprofiling (728 genes) und INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling (728 genes) direkt vergleichen?

Ja, die beiden Dienste eignen sich bestens für Studien, deren Ziel ein Vergleich der Leistungsfähigkeit herkömmlicher Biopsien gegenüber Flüssigbiopsien ist.

Wo liegen die Grenzen der CNV-Analyse?

Auch bei Einreichung zusammengehöriger Proben (Tumorgewebe und Normalgewebe oder Blut vom selben Patienten) kann die gekoppelte Analysemethode Einschränkungen unterliegen. Die Varianz der Messungen an dieser einzelnen zugehörigen Referenzprobe wird höher sein als die einer Referenz, die aus mehreren Referenzproben besteht. Dies könnte zu einer geringen Anzahl von (falsch-positiven) CNV-Identifizierungen führen – auch in Fällen, in denen zwei zusammengehörige Proben tatsächlich die identische Kopienzahl haben.

Werden alle Varianten in meiner Probe erkannt?

Die Heterogenität eines Tumors kann eine korrekte Identifizierung aller relevanten Kopienzahlvariationen in einer gegebenen Probe erschweren. Auch wenn der Tumor selbst homogen ist, kann eine übermäßige Verunreinigung mit normalen Zellen zu Unterschieden bezüglich der Abdeckung führen, die selbst bei den hochsensitiven Methoden von Eurofins Genomics zu klein sind, um nachgewiesen zu werden.

Kann ich INVIEW Oncoprofiling (728 genes) für diagnostische Zwecke verwenden?

Das Produkt steht nur für Forschungszwecke zur Verfügung. Der Service wird in einem nach ISO17025:2005 akkreditierten und nach ISO13485:2016 zertifizierten Labor durchgeführt. 

INVIEW Metagenome

Allgemeine Fragen zur Probenübermittlung, Bestellung, zum Probenversand und zu Ergebnissen finden Sie hier:

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Welche Art von Proben kann verwendet werden?

Für INVIEW METAGENOME ADVANCE akzeptieren wir aus der klinischen Forschung stammende Proben menschlichen Ursprungs (z. B. Abstriche, Faeces, Lavage). Auf Anfrage können für die Analyse des gesamten Metagenoms viele Arten von Ausgangsmaterialien verwendet werden, wie z. B.:

Lebensmittelproben für die Qualitätskontrolle und Nachweis von Pathogenen im industriellen Umfeld (Molkereien, Brauereien, fleischverarbeitende und landwirtschaftliche Einrichtungen)
Umweltproben
Eurofins Genomics hat besonders viel Erfahrung mit der DNA-Isolierung und Sequenzierung von Stuhlproben.

Wieviel Ausgangsmaterial wird benötigt?

Spezifische Informationen über die für spezielle Methoden der Bibliothekerstellung benötigte Menge und Konzentration finden Sie in Ihrem Angebot – oder Sie wenden sich direkt an uns. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, benötigen wir in der Regel > 100 ng aufgereinigte Doppelstrang-DNA (die Gesamtmenge hängt vom Anteil mikrobieller DNA in der Probe ab). Bitte beachten Sie, dass die DNA RNA-frei sein und eine OD 260/280 von > 1,8 und OD 260/230 von > 2,0 haben muss.

Welche Art von Daten erhalte ich?

Eurofins Genomics liefert Tabellen (TSV, TXT) mit Auflistungen aller in Ihrer Probe vorhandenen Gattungen und den jeweiligen Read-Anzahlen. Zusätzlich erhalten Sie alle Rohdaten der Sequenzierung.

Operationale taxonomischen Einheiten (OTUs), klassifiziert vom Kraken‘schen exakten k-mer-Alignmentalgorithmus und der entsprechenden MiniKrakenDB-Datenbank, werden in Tabellenform mit taxonomischer Identifizierung dargestellt.

Welche Abdeckung ist für die Metagenom-Analyse notwendig?

Die für die Metagenom-Sequenzierung erforderliche Sequenzierungstiefe richtet sich vor allem nach der Komplexität der Probe (der Anzahl und Repräsentation der einzelnen Spezies) sowie nach dem Grad der erwarteten Wirtskontamination. Mikrobengemeinschaften hoher Komplexität mit hohen Hintergrundwerten an Wirts-DNA erfordern mehr Abdeckung als Proben geringerer Komplexität und mit einem geringeren Grad an Wirts-DNA-Kontamination. Im Zweifelsfall empfehlen wir, die erforderliche Sequenzabdeckung anhand eines Pilotversuchs an einer Untergruppe von Proben zu bestimmen.

Garantieren Sie einen bestimmten Output für die Sequenzierung?

Ja, Inview Metagenome Advance beinhaltet eine Garantie für 10 Millionen Read-Paare. Weitere Read-Pakete können separat bestellt werden.

Welche Organismen können nachgewiesen werden?

Die Metagenomanalyse ermöglicht die Identifizierung von Mikroorganismen unabhängig von taxonomischen Markern wie z. B. 16S rRNA. Anhand der Metagenomsequenzierung können sowohl kultivierbare als auch nicht-kultivierbare Organismen wie z. B. Bakterien, Archaeen, Pilze, Protozoen und Viren identifiziert werden. Zwar hat Eurofins Genomics am meisten Erfahrung mit der Profilierung der humanen Mikrobiota, wir charakterisieren jedoch auch mit Erfolg Elemente aus Mikrobengemeinschaften aus Lebensmittel-, Industrie und Umweltproben.

Welchen Service soll ich wählen – die gezielte Amplikon-Sequenzierung oder Metagenom-Sequenzierung?

Sowohl Amplikon- als auch Metagenom-Sequenzierung weisen klare Vorteile sowie auch Nachteile auf. Ihre Methode der Wahl sollte sich nach Ihrem Forschungsziel richten. Der Erfolg eines Projekts hängt in der Regel von mehreren Faktoren ab, wie z. B. von der Zusammensetzung der Gemeinschaft, der Häufigkeit eng verwandter Arten und der Sequenzierungstiefe.

Amplikon-Sequenzierung bietet eine zweckmäßige taxonomische Profilerstellung einer großen Anzahl von Proben. Dieser Ansatz ermöglicht die Erkennung von feinen Unterschieden zwischen Mikrobengemeinschaften; daher ist die Methode für statistische Vergleiche vorteilhaft, wie z. B. für Fall-Kontroll-Studien oder für Probenahmen aus unterschiedlichen Umgebungen im Lauf der Zeit.

Metagenom-Sequenzierung ist nicht auf einen bestimmten Satz von Primern angewiesen, wodurch die Methode frei ist von taxon-spezifischem PCR-Bias. Dadurch sind präzisere Darstellungen der analysierten Mikrobiota und zuverlässigere Schätzungen von Artenhäufigkeiten möglich. Die Metagenomanalyse kann Informationen sowohl über die taxonomischen als auch die funktionellen Eigenschaften einer bestimmten Probe liefern.

Was ist der Unterschied zwischen Inview Metagenome Explore und Inview Metagenome Advance?

Inview Metagenome Explore ist ideal geeignet für eine breit angelegte taxonomische Profilierung aller in einem bestimmten Mikrobiom vorhandenen Organismen. Die inbegriffenen 10 Millionen Read-Paare eignen sich zur Analyse von Metagenomen geringer Komplexität sowie auch für eine umfassende Übersicht über Gattungen in komplexen Metagenomen. Eine tiefere Sequenzabdeckung kann anhand von zusätzlichen Read-Paketen erreicht werden.

Inview Metagenome Advance bietet zusätzlich zur taxonomischen Charakterisierung eine detaillierte Beurteilung von Antibiotikaresistenzen und der Funktion in der Gemeinschaft. Das Produkt ist ideal für die Profilerstellung komplexer Metagenome. Für eine tiefere Sequenzabdeckung als die inbegriffenen 10 Millionen Read-Paare können zusätzliche Read-Pakete hinzugefügt werden. Der Service kann auf die Quantifizierung funktioneller Prozesse in einer speziellen Gemeinschaft oder auf die Erkennung zahlreicher Resistenzfaktoren in einer ungestörten natürlichen Umgebung angewendet werden. Bitte beachten Sie, dass die erforderliche Sequenziertiefe für eine erfolgreiche Metagenomprofilierung stark von der Komplexität und dem erwarteten Grad an Wirtskontamination des Ausgangsmaterials beeinflusst wird. Daher ist möglicherweise ein zusätzlicher Sequenzier-Aufwand erforderlich, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen.

Transcriptome Sequencing / RNA-Seq

Allgemeine Fragen zur Probenübermittlung, Bestellung, zum Probenversand und zu Ergebnissen finden Sie hier:

Allgemeine FAQs im Bereich Next Generation Sequencing >>

Welches INVIEW Transkriptom-Paket empfehlen Sie für welchen Anwendungsbereich?

 

Dies hängt von vielen Faktoren ab, wie u. a. von der Art der Gewebes, der Probenqualität, dem Entwicklungsstadium, den vorhandenen Sequenzen usw.. Entnehmen Sie bitte der Tabelle unter „Produktspezifikationen“ Ihre optimale INVIEW Transcriptome-Lösung. Die dort angegebenen geschätzten Read-Anzahlen beziehen sich auf humane Proben. Alternativ können Sie uns kontaktieren, um Ihr Projekt mit uns zu besprechen. In bestimmten Fällen ist es möglicherweise ratsam, mit Hilfe eines Testlaufs zu ermitteln, wie viele Reads für Ihren speziellen Zweck oder Organismus benötigt werden.

Das INVIEW Transcriptome Discover verwendet eine strangspezifische RNA-Library kombiniert mit 150 bp Paired-End-Sequenzierung von Illumina. Somit empfiehlt sich das Paket für die Erkennung von differenziell exprimierten Genen, seltenen und neuen Transkripten sowie für die Entdeckung von Spleißvarianten. Darüber hinaus ermöglichen die Informationen über die Orientierung des Transkripts eine präzisere Bestimmung von Struktur und Genexpression.

Das INVIEW Transcriptome Bacteria beinhaltet 10 Millionen Reads / Read Paare und ist somit günstiger als das INVIEW Transcriptome Explore / Discover. 10 Millionen Reads / Read Paare sind aber für die meisten Untersuchungen bakterieller RNA völlig ausreichend.

Das INVIEW Transcriptome Ultra Low ist speziell für Projekte mit nur sehr sehr wenig Ausgangsmaterial entwickelt.

 

Brauche ich eine genomische Referenzsequenz?

INVIEW Transcriptome Discover:

Nicht unbedingt. Sollten Sie jedoch eine Referenz haben, nehmen Sie bitte die folgenden Empfehlungen unten zur Kenntnis.

 

INVIEW Transcriptome Bacteria / Ultra Low:

Ein klar definierter Ensembl-Name (z. B. GRCh37 oder Rnor_5.0) für die annotierte genomische Referenzsequenz muss vor Projektbeginn zur Verfügung gestellt werden. Alternativ kann die Genomsequenz in Fasta bereitgestellt werden (zusammen mit der entsprechenden Annotation im Gene Transfer Format (GTF) oder im GenBank-Format, einschließlich Annotation).

Welche Ausgangsmaterialien werden akzeptiert?

Zur Erstellung von Libraries für die Sequenzierung kann Gesamt-RNA aus Gewebe, Zellen oder Körperflüssigkeiten von eukaryotischen oder prokaryotischen Organismen verwendet werden. Zusätzlich zu aus frischem Gewebe isolierter RNA kann auch RNA aus FFPE-Proben analysiert werden. RNA-Isolation kann als Zusatzleistung angeboten werden. Bei Fragen zu Ausgangsmaterial aus anderen Quellen sprechen Sie uns bitte an.

Für das INVIEW Transcriptome Ultra Low können wir keine Zellen in Zellkultur annehmen. Desweiteren können wir hier nicht garantieren, das genug RNA extrahiert werden kann.

 

Wieviel Ausgangsmaterial wird benötigt?

Informationen über die für spezielle Methoden der Library-Erstellung benötigte RNA-Menge und -Konzentration finden Sie in Ihrem Angebot – oder Sie wenden sich an uns. In der Regel benötigen wir für optimale Ergebnisse 150 ng hochwertige RNA (bis zu 15 μl / optimale Konzentration 6 - 50 ng / μl (maximale Konzentration 200 ng / μl) mit einer OD 260/280 von 1,8 – 2,0 und einer OD 260/230 von 2,0 – 2,2. Möglicherweise kann mit weniger Material begonnen werden, doch dies hängt in hohem Maß von der Qualität des Materials und der gewünschten Library ab.
Die Qualität und Quantität des bereitgestellten Ausgangsmaterials sind für den Erfolg der Probenvorbereitung entscheidend. Bei Verwendung von zu wenig oder degradiertem, kontaminiertem oder anderweitig geschädigtem Ausgangsmaterial kann die Folge ein sehr niedriger Ertrag, eine fehlgeschlagene Probenvorbereitung sowie eine beeinträchtigte Qualität und Quantität der Sequenzierungsergebnisse sein.

 

Für das INVIEW Transcriptome Ultra Low:

Mindestens 0.15 ng/µl (in min. 10 µl). RIN > 6.5

 

Kann eine RNA-Isolation angeboten werden?

Eurofins Genomics bietet RNA-Isolation als Zusatzleistung an. Wir haben die Protokolle zur Extraktion von qualitativ hochwertiger RNA aus mehreren Probenarten und Ausgangsmaterialien erfolgreich optimiert. Weitere Informationen zur RNA-Isolation finden Sie in den Produktspezifikationen – oder lassen Sie sich von uns direkt beraten: Wir besprechen mit Ihnen mögliche Methoden der Probenvorbereitung für Ihre individuellen Anforderungen.

Welche Ausgangsmaterialien und Ziele sind zur Durchführung der rRNA-Abreicherung am besten geeignet?

a) Für Eukaryoten: Eine rRNA-Abreicherung empfiehlt sich für teilweise degradierte RNA oder bei Sequenzierung der RNA ohne Poly-A-Schwanz.

b) Für Prokaryoten empfehlen wir generell eine rRNA-Abreicherung, da eine poly-(A)-Anreicherung von prokaryotischen Transkripten nicht durchführbar ist.


Eine rRNA-Abreicherung kann bei Eurofins Genomics angefordert werden. Alternativ können Sie uns eine bereits rRNA-abgereicherte/mRNA-angereicherte RNA als Ausgangsmaterial zur Verfügung stellen (20 ng pro Probe (bis zu 15 µl / Konzentration >1,4 ng/µl)). Weitere Informationen finden Sie in den Produktspezifikationen

 

Wie effizient ist die rRNA-Abreicherung?

Die Effizienz der RNA-Entfernung richtet sich nach dem Organismus, der Zusammensetzung und der Qualität Ihrer Proben-RNA. Bei stark degradierter RNA kann eine Ribo-Abreicherung weniger effizient sein.

Soll ich mein Ausgangsmaterial auf Trockeneis verschicken oder ist Raumtemperatur ausreichend?

RNA muss auf Trockeneis versandt werden, sofern sie nicht mit Ethanol ausgefällt wurde. Gewebe/Zellkulturen müssen in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis schockgefroren und auf Trockeneis versandt werden. Alternativ kann frisches Material in „RNAlater“ (z. B. von Ambion, SIGMA oder QIAGEN) stabilisiert und bei Raumtemperatur versandt werden. Bitte prüfen Sie im Voraus, ob der von Ihnen beauftragte Kurier Trockeneisversand anbietet.

Warum empfehlen Sie, ribosomale RNA zu entfernen?

Da ribosomale RNA (rRNA) den Großteil einer Gesamt-RNA-Probe ausmacht, empfehlen wir, sie zu entfernen, um die Probe für andere RNA-Typen anzureichern. Dies kann entweder durch eine Poly-A-Selektion oder eine rRNA-Depletion erreicht werden, beide Methoden helfen, die Analyse auf informativere RNA-Populationen zu konzentrieren.

RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Transkriptomanalyse, und die Wahl zwischen PolyA-Anreicherung und rRNA-Depletion hängt von den spezifischen Zielen des Experiments und den Arten von RNA ab, die Sie untersuchen möchten. Hier ist eine Übersicht, wann jede Methode sinnvoll ist:

1. PolyA-Anreicherung

PolyA-Anreicherung isoliert selektiv mRNA, indem sie an die PolyA-Schwänze bindet, die am 3'-Ende der meisten eukaryotischen mRNAs zu finden sind. Dies ist nützlich, wenn Sie hauptsächlich an kodierender RNA (mRNA) interessiert sind, und vereinfacht die Analyse, indem die Komplexität der Probe reduziert wird.

Wann sollte man PolyA-Anreicherung verwenden?

  • Fokus auf mRNA: Wenn Ihr Ziel darin besteht, protein-kodierende Gene zu analysieren, ist die PolyA-Anreicherung ideal, da sie die meisten mRNAs mit einem PolyA-Schwanz erfasst (was den Großteil des Transkriptoms in eukaryotischen Zellen ausmacht).
  • Eukaryotische Proben: Die meisten eukaryotischen mRNAs haben PolyA-Schwänze, was die PolyA-Anreicherung besonders nützlich für diese Spezies macht.
  • Reduzierung der rRNA-Interferenz: In RNA-Proben mit hohem rRNA-Gehalt hilft die PolyA-Anreicherung, die rRNA-Kontamination zu reduzieren, indem sie selektiv mRNA anreichert, obwohl sie rRNA nicht vollständig entfernt.
  • mRNA-Profilierung: Wenn Sie Transkriptomik durchführen, um Genexpressionsniveaus oder alternatives Spleißen in kodierenden Regionen zu verstehen, ist die PolyA-Anreicherung effektiv.

Einschränkungen:

  • Nicht-polyadenylierte RNAs: Sie erfasst keine nicht-polyadenylierten RNA, wie lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs), miRNAs, rRNAs und einige kleine RNAs.

Überlegungen für minderwertige RNA (PolyA-Anreicherung):

  • Reduzierte mRNA-Erfassung: Wenn die mRNA fragmentiert oder degradiert ist, erfasst die PolyA-Anreicherung hauptsächlich das 3'-Ende der mRNA, und es könnte zu einem Verlust wichtiger Daten kommen. Dies ist oft der Fall bei RNA, die aus FFPE-Schnitten extrahiert wurde.
  • Moderate Degradation: Die PolyA-Anreicherung kann immer noch nützlich sein, wenn die RNA-Degradation moderat ist (d.h. nicht stark fragmentiert), solange eine ausreichende Menge intakter polyadenylierter RNA vorhanden ist.

2. rRNA-Depletion

Die rRNA-Depletion entfernt den Großteil der ribosomalen RNA (rRNA), die 80-90% der Gesamt-RNA in den meisten eukaryotischen Zellen ausmacht. Durch die Depletion der rRNA können Sie andere RNA-Typen analysieren, die weniger häufig vorkommen, wie mRNA (in Fällen, in denen die PolyA-Anreicherung nicht bevorzugt wird), lncRNAs, kleine RNAs und andere nicht-kodierende RNAs.

Wann sollte man rRNA-Depletion verwenden?

  • Umfassende Transkriptomanalyse: Wenn Ihr Ziel darin besteht, alle Arten von RNA zu untersuchen, einschließlich nicht-kodierender RNAs (wie lncRNAs und miRNAs), kleiner RNAs oder sogar nicht-polyadenylierter mRNAs, ist die rRNA-Depletion eine bessere Option, da sie diese RNA-Typen bewahrt.
  • Prokaryotische Proben: In Prokaryoten (die rRNA als die häufigste RNA haben) wird die rRNA-Depletion häufig verwendet, um die Qualität der RNA-Seq-Daten zu verbessern, da prokaryotische mRNAs keine PolyA-Schwänze haben.

Einschränkungen:

  • Teilweise rRNA-Entfernung: In einigen Fällen entfernen rRNA-Depletionsmethoden möglicherweise nicht alle rRNA-Spezies, sodass einige Restmengen verbleiben.

Überlegungen für minderwertige RNA (rRNA-Depletion)

  • Schwere RNA-Degradation: Die rRNA-Depletion eignet sich besser für minderwertige oder degradierte RNA, z.B. RNA, die aus FFPE-Schnitten extrahiert wurde, da sie nicht auf die Integrität der PolyA-Schwänze angewiesen ist. Auch bei fragmentierter RNA kann die rRNA-Depletion die rRNA-Kontamination effektiv reduzieren.

Zusammenfassung:

  • PolyA-Anreicherung ist optimal, wenn Sie sich auf mRNA konzentrieren und die RNA-Qualität hoch bis moderat ist. Sie ist weniger effektiv, wenn die RNA degradiert ist oder wenn Sie nicht-polyadenylierte RNAs analysieren müssen.
  • rRNA-Depletion funktioniert gut für alle nicht-rRNA-Typen und prokaryotische mRNA, insbesondere wenn Sie ein breiteres Spektrum von RNA erfassen möchten, einschließlich nicht-polyadenylierter RNAs wie lncRNAs. Diese Methode ist auch ideal, wenn Sie mit stark degradierter RNA arbeiten.

Für welche Organismen bieten sie die rRNA Abreicherung an?

Wir bieten rRNA-Depletion unter Verwendung spezialisierter Kits für eine Vielzahl von Organismen an, einschließlich Mensch, Maus, Ratte, Bakterien und Pflanzen. Diese Kits sind darauf ausgelegt, ribosomale RNA effizient zu entfernen, wodurch eine fokussiertere Analyse des Transkriptoms in diesen Spezies ermöglicht wird.

Können Sie auch bei anderen Säugetierarten eine rRNA-Depletion durchführen?

Unser rRNA-Depletionsservice ist mit einer Vielzahl von Säugetierarten kompatibel, obwohl die Depletionseffizienz je nach Art variieren kann. Hier ist eine Zusammenfassung der rRNA-Depletionseffizienzen für mehrere Arten basierend auf Schätzungen:

  • Huhn: 82%
  • Kuh: 98%
  • Javaneraffe (Macaca fascicularis): 88%
  • Hund: 90%
  • Hamster: 95%
  • Pferd: 98%
  • Schwein: 80%
  • Kaninchen: 81%
  • Schaf: 95%

Können Sie auch bei verschiedenen Pflanzenarten eine rRNA-Depletion durchführen?

Unser rRNA-Depletionsservice ist mit einer Vielzahl von Pflanzenarten kompatibel, obwohl die Depletionseffizienz je nach Art variieren kann. Hier ist eine Zusammenfassung der rRNA-Depletionseffizienzen für mehrere Arten basierend auf Schätzungen:

  • Arabidopsis: 99%
  • Gerste: 92%
  • Mais: 90%
  • Baumwolle: 99%
  • Leinsamen: 87%
  • Ahorn: 89%
  • Hafer: 99%
  • Kartoffel: 93%
  • Reis: 91%
  • Roggen: 99%
  • Sorghum: 79%
  • Sojabohne: 93%
  • Weizen: 94%

Welche Methode empfehlen Sie zur Analyse von aus Blut extrahierter RNA?

Zur Analyse von RNA aus Blutproben empfehlen wir sowohl die rRNA-Depletion als auch die Globin-mRNA-Depletion. Da Globin-mRNA einen erheblichen Anteil der RNA im Blut ausmacht, hilft deren Depletion zusammen mit der rRNA-Depletion, die Probe für andere weniger häufige, aber biologisch relevante RNA-Spezies anzureichern.

Welche Methode verwendet Ihr für INVIEW Transcriptome Ultra Low?

Für Ultra-Low Input RNA-Seq verwenden wir die Poly-A-Selektion, um mRNA anzureichern, da sie sehr effektiv darin ist, das Transkriptom aus kleinen RNA-Mengen zu erfassen. Bitte beachten Sie, dass für diesen Service aufgrund der begrenzten Menge an Eingangs-RNA keine rRNA-Depletion verfügbar ist.

Daher ist Ultra-Low Input RNA-Seq nur für eukaryotische RNA verfügbar.

Wie viele Reads benötige ich für mein Experiment?

Die erforderliche Anzahl an Reads hängt von Faktoren wie der Größe des Genoms, der Anzahl der bekannten Gene und Transkripte ab. Als allgemeine Richtlinie empfehlen wir:

  • 5-10 Millionen Read-Paare pro Probe für kleine Genome (z.B. Bakterien)
  • 20-30 Millionen Reads pro Probe für größere Genome (z.B. Mensch, Maus)
  • Für mittelgroße Genome (z.B. Hefe) kann die erforderliche Anzahl an Reads je nach Projekt variieren, aber typischerweise schlagen wir 15-20 Millionen Reads pro Probe vor.
  • Für de novo Transkriptom-Assemblierungsprojekte empfehlen wir etwa 100 Millionen Reads pro Probe.

Welche bioinformatischen Services sind für RNA-Seq Projekte verfügbar?

Wir stellen Rohdaten als FASTQ-Dateien für alle Projekte zur Verfügung. Darüber hinaus bieten wir fortgeschrittene bioinformatische Dienstleistungen an, die optional zur Datenanalyse genutzt werden können. Die verfügbaren bioinformatischen Dienstleistungen für RNA-Seq-Projekte sind wie folgt:

Standardanalyse:

  • Qualitätsbewertung der Sequenzierungsdaten
  • Ausrichtung der Reads auf ein Referenzgenom
  • Assemblierung und Quantifizierung von Transkripten
  • Normalisierung der Genanzahl
  • Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Genen
  • Hauptkomponentenanalyse (PCA)
  • Signifikanztests
  • Erstellung detaillierter Berichte und Visualisierungen

Optionale Analyse:

  • Analyse des alternativen Spleißens (AS)
  • Genfusion-Analyse
  • Varianten-Erkennung und deren Auswirkungen auf Proteinveränderungen

Erweiterte Analyse:

  • Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA)

Jeder Service umfasst spezifische Ergebnisse und hat damit verbundene Kosten und Bearbeitungszeiten.

Welche Daten kann ich erwarten, wenn ich die Gesamt-RNA (total RNA) sequenziere?

Wenn die Gesamt-RNA sequenziert wird, dann erhalten sie eine Vielzahl von RNA-Typen, einschließlich:

  • mRNA: Liefert Informationen zur Genexpression.
  • rRNA: Dominiert die meisten RNA-Proben, es sei denn, sie wird depletiert.
  • tRNA und nicht-kodierende RNAs: Kleinere Mengen, aber sie spielen wichtige regulatorische Rollen.

Ohne spezifische Anreicherung wird rRNA wahrscheinlich die Daten dominieren.

Warum trimmen Sie die Input RNA-Seq – Ultra Low Daten vor der Lieferung?

Während des RNA-Seq – Ultra Low Bibliotheksvorbereitungsprozesses werden Primer- und Adaptersequenzen während der cDNA-Synthese und -Amplifikation zur RNA hinzugefügt. Diese Sequenzen sind für den Sequenzierungsprozess notwendig, gehören jedoch nicht zum eigentlichen biologischen Transkript. Wenn sie in den Daten verbleiben, können sie Rauschen verursachen und die Qualität der Sequenzierungsergebnisse verringern. Um hochwertige Daten zu gewährleisten, trimmt Eurofins diese Sequenzen vor der Lieferung, was zu leicht verkürzten Sequenzierungsreads führen kann.

Amplikon-Sequenzierung (Kurze Reads)

Allgemeine Fragen zur Probenübermittlung, Bestellung, zum Probenversand und zu Ergebnissen finden Sie hier:

Allgemeine FAQs im Bereich Next Generation Sequencing >>

Wie soll ich meine Amplikons aufreinigen?

Wir empfehlen, Ihre Amplicons mit kommerziell erhältlichen Kits auf Basis von DNA-bindenden Beads oder Säulen oder durch enzymatische Reinigung aufzubereiten. Schicken Sie KEINE Primer mit Ihren Proben oder in Ihre Proben gemischt.

Welche Probenarten können für die Amplikon-Sequenzierung eingesendet werden?

Reichen Sie gereinigte PCR-Produkte mit einer Größen von 150–270 bp (NovaSeq) oder 280–570 bp (MiSeq) ein. Die Amplicons sollten idealerweise ein einzelnes Band auf einem Gel erzeugen, um optimale Ergebnisse zu gewährleisten.

Kann ich auch Amplikons schicken die größer oder kleiner sind als die Vorgaben?

Nein, es werden ausschließlich Amplikons innerhalb unserer Größenbereiche 150–270 bp für NovaSeq oder 280–570 bp für MiSeq) akzeptiert. Für größere Produkte empfehlen wir unsere ONT-Amplicon-Sequenzierungsdienste. Wenn Sie sich bei der Produktauswahl unsicher sind, wenden Sie sich bitte an Ihren Vertriebsmitarbeiter.

Wie kann ich mehrere Amplikons in einer Probe multiplexen?

Für 150–270 bp lange Amplicons, die auf unserer NovaSeq sequenziert werden, nutzen Sie bitte unser **Inline Tag Design Tool**: NGS Adapter Ligation Oligos (eurofinsgenomics.eu). Wählen Sie beim Bestellen den optionalen Service „Tag sorting – Eurofins Genomics Design“. Sie erhalten sortierte Sequenzen (FASTQ).

  • **192 individuelle Inline-Tags** stehen zur Verfügung, jeweils bestehend aus 10 Nukleotiden, die dem Forward-Primer hinzugefügt werden.
  • Es gibt einen minimalen Editierabstand von 4, um Fehlzuweisungen durch Sequenzierfehler zu vermeiden.
  • Die Tags sind für sowohl kleine als auch große Probenpools optimiert.
  • Alle "NGS-grade-Oligos" durchlaufen spezifische Prozesse, um eine kontaminationsfreie und hochreine Performance sicherzustellen.
  • Für das Multiplexing von 24 Proben mit der gleichen Zielsequenz werden 24 Forward-Primer (jeder mit einem einzigartigen Inline-Tag) und ein Reverse-Primer (ohne Tags) benötigt.

Können wir für das Produkt NGSelect Amplicon auf dem MiSeq Amplikonproben einschicken, die aus mehreren verschiedenen Amplikons, generiert mit verschiedenen Primerpaaren bestehen?

Normalerweise würden Sie pro Probe 1 Amplikon senden, das mit 1 Primerpaar erzeugt wurde.

In einigen Fällen können jedoch weniger Reads pro Amplikon erforderlich sein, wie in der Projektspezifikation angegeben. In solchen Fällen können die einzelnen Amplikonproben, die Sie senden, auch aus mehreren Amplikons bestehen, die mit verschiedenen Primerpaaren generiert wurden. In diesem Fall werden wir jedoch keine Primersequenzen clippen.

Probenvorbereitung – für Amplicon-Sequenzierung auf Illumina (Short-Read). Welche Richtlinien gelten für die Probenübermittlung?

Amplikons auf NovaSeq:

Schicken Sie mindestens 25 µL gereinigte PCR-Produkte mit einer Größe von 150–270 bp, mit einer Konzentration von > 4 ng/µL und einer Reinheit (A260/280) von 1,8–2,0. Die Amplikons dürfen keine TruSeq-Adaptersequenz enthalten.

Amplikons auf MiSeq:

Reichen Sie mindestens 25 µL gereinigte PCR-Produkte mit einer Größe von 300–570 bp ein, mit einer Konzentration von > 1 ng/µL und einer Reinheit (A260/280) von 1,8–2,0. Die Amplicons müssen TruSeq-Adaptersequenzen enthalten.

 

 

Die Proben können in RNase-, DNase- und proteasefreiem Wasser, EB- oder niedrigem TE-Puffer vorliegen.

Bitte beachten Sie auch auch die Probenvorbereitungsinformationen in den allgemeinen FAQs, um weitere Informationen zu organisatorischen Themen und zur Vorbereitung Ihrer Proben vor dem Versand an unsere Standorte zu erhalten.

NGSelect Ready-To-Load

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Was soll ich tun, wenn meine Probe die Eingangskontrolle (Entry QC) nicht besteht?

Wenn die Menge, Konzentration oder Qualität der sequenzierbereiten Bibliothek nicht den Anforderungen für die weitere Probenverarbeitung entspricht, werden wir Sie kontaktieren, um das weitere Vorgehen im Projekt zu besprechen. Wann immer möglich, wird Eurofins Genomics Empfehlungen zur Optimierung der Probenqualität geben.

Ist das Sortieren von gemultiplexten Sequenzen inbegriffen?

Die Sortierung der Rohdaten anhand des Illumina-Index-Reads ist kostenlos. Der verwendete Indextyp (einfach indiziert oder (eindeutig) doppelt indiziert) sowie die entsprechenden Indexsequenzen müssen vor Projektbeginn im Proben-Einreichungsformular angegeben werden.

Garantieren Sie eine bestimmte Anzahl an Reads?

Die tatsächlich erzielte Sequenzierleistung (Read-Länge, Read-Qualität und Anzahl der Reads) hängt direkt von der Qualität der verwendeten Sequenzierbibliothek ab. Eurofins Genomics kann keine Garantie für Sequenzierdaten übernehmen, die aus vom Kunden vorbereiteten einsatzbereiten Bibliotheken stammen. Sollten unzufriedenstellende Sequenzierergebnisse auf technische Probleme mit den Sequenzierkits oder -geräten zurückzuführen sein, wird die Sequenzierung ohne zusätzliche Kosten für den Kunden wiederholt.

Kann Eurofins das Demultiplexing von „In-Line“-Barcodes in Sequenzier-Reads durchführen?

Ja, wir bieten das Demultiplexing von „In-Line“-Barcodes in Sequenzier-Reads (nicht in Index-Reads) an. Wir empfehlen jedoch dringend, auf die Verwendung von „In-Line“-Barcodes zu verzichten und stattdessen das Illumina-Indexsystem zu nutzen (d. h. die Barcodes werden in einem separaten Read ausgelesen und beeinträchtigen nicht die Cluster-Erkennung).

Es ist wichtig, darauf zu achten, dass die Basenzusammensetzung der Indizes ausgewogen ist, um die Signalunterscheidung durch die Bildanalyse-Software zu optimieren.

Bitte kontaktieren Sie uns für weitere Details. Für diesen Service fallen zusätzliche Kosten an.

Welche Art von einsatzbereitem Bibliothekspool kann ich einreichen?

Sie können jeden Bibliothekspool einreichen, der mit Illumina®-Sequenzierung kompatibel ist, einschließlich solcher, die aus genomischer DNA für Whole-Genome-Sequenzierung, RNA für Transkriptomanalysen oder Amplicon-Bibliotheken hergestellt wurden. Bitte beachten Sie, dass das Pooling verschiedener Bibliotheken zu einem finalen einsatzbereiten Pool von den Kunden selbst durchgeführt werden muss – dieser Service wird von Eurofins Genomics nicht angeboten.

Illumina-kompatible Bibliotheken müssen vier zentrale Komponenten in ihren Adaptersequenzen enthalten – diese befinden sich an den Enden jedes Fragments – um eine erfolgreiche Paired-End-Sequenzierung zu ermöglichen:

  • Flow-Cell-Bindungsstellen (P5 und P7): Ermöglichen die Bindung und Clusterbildung der DNA-Fragmente auf der Flow Cell.
  • Sequenzierprimer-Bindungsstellen (Read 1 und Read 2): Starten die Sequenzierung von beiden Enden des DNA-Fragments.
  • Indexsequenzen (i5 und i7): Auch als Barcodes bekannt, ermöglichen sie das Multiplexing von Proben. Bibliotheken können einfach (ein Index) oder doppelt (zwei Indizes) indiziert sein. Für NovaSeq liegt die empfohlene Barcodelänge bei 8–12 bp, für MiSeq empfehlen wir maximal 10 bp lange Indexsequenzen.
  • Indexprimer-Bindungsstellen: Diese sind notwendig, um die Indexsequenzen während der Sequenzierung auszulesen.

 

Single-Index Bibliothek

 

Dual-Index Bibliothek

 

Die Struktur der Adaptersequenzen variiert je nachdem, ob die Bibliothek mit einfacher oder doppelter Indizierung arbeitet. Fehlende, falsch konfigurierte oder stark modifizierte Komponenten können dazu führen, dass die Sequenzierung fehlschlägt. Wenn Sie sich bezüglich der Konfiguration Ihrer Bibliothek unsicher sind, können Sie sich gerne an uns wenden – wir beraten Sie gerne.

Können Sie PhiX in meinen Sequenzierlauf einspiken?

Die Cluster-Erkennungsalgorithmen von Illumina sind auf eine ausgewogene Verteilung der Nukleotide A, T, G und C optimiert. Jede Abweichung von dieser Gleichverteilung wirkt sich negativ auf die Menge und Qualität der erzeugten Sequenzierdaten aus.

Um die Nukleotidverteilung in der Bibliothek auszugleichen, wird bei Proben mit geringer Diversität oder unausgewogener Basenzusammensetzung (z. B. Amplicons, bisulfitkonvertierte Proben) ein Spike-in von 20 % PhiX (bei MiSeq) verwendet.

Das Ausmaß, in dem der negative Einfluss einer unausgewogenen Basenzusammensetzung durch den PhiX-Kontroll-Spike-in reduziert werden kann, hängt von den individuellen Eigenschaften der Probe und der Sequenz ab.

Weitere Informationen finden Sie auf der Website von Illumina.

Können Sie eine Datenanalyse für mein einsatzbereites Projekt durchführen?

Ja, wir bieten auf Wunsch eine optionale Datenanalyse an. Bitte geben Sie dies im Angebotsformular an.

INVIEW Liquid Biopsy Oncoexome

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Welche Art von kann mit INVIEW Liquid Biopsy Oncoexome verarbeitet werden?

Für das INVIEW Liquid Biopsy Oncoexome akzeptieren wir frische oder aufbewahrte Plasmaproben, sowie bereits isolierte zellfreie DNA. Weiteres entnehmen Sie bitte unserem Informationsblatt zur Probenvorbereitung für Liquid Biopsy Produkte (siehe "Dateien"). Die ctDNA wird aus Blutplasma extrahiert.
Für Ausgangsmaterial wie z. B. aus FFPE und Gewebeproben isolierte DNA sehen Sie sich bitte unser Produkt INVIEW Human Exome an.

Wie viel Ausgangsmaterial wird benötigt?

In der Regel benötigen wir entweder 4 ml Plasma oder 15 ng bereits isolierte zellfreie DNA(bis zu 30 µl /Konzentration > 0,5 ng/µl). 

Welche der Sequenzierung vorausgehenden Leistungen stehen zur Verfügung?

Das Produkt INVIEW Liquid Biopsy Oncoexome umfasst mehrere Leistungen im Vorfeld der Sequenzierung, z. B. ctDNA-Extraktion aus Plasma und Bibliothekerstellung mit hoher Komplexität und niedriger Duplikatrate. Die gezielte Suche von Exons erfolgt mit SureSelect von Agilent, das eine überdurchschnittliche Exon-Anreicherung und gleichförmige Abdeckung bietet.

Was für eine Sequenzabdeckung soll ich verwenden?

Die erforderliche Abdeckung ist von der erforderlichen Empfindlichkeit der Variantenerkennung abhängig. Sie können die Sequenzabdeckung wählen, die Sie für Ihr individuelles Projekt und Studienziel benötigen.
Basierend auf Erfahrungen aus der Analyse zellfreier DNA von mehr als 40.000 Proben bis zum heutigen Tag empfehlen wir generell eine Abdeckung von 100x.

Welches Produkt soll ich wählen – Oncoexome, Oncoprofiling oder Oncotarget?

Alle drei Tests beruhen auf Flüssigbiopsie. Bei allen drei Produkten handelt es sich um leistungsstarke, nichtinvasive Hilfsmittel zur Charakterisierung von Tumoren in Echtzeit. Mit ihrer Hilfe kann die gesamte Heterogenität der Erkrankung erfasst werden.

INVIEW Liquid Biopsy Oncoexome ist der erste kommerziell erhältliche Service für die Gesamtexom-Sequenzierung (WES) von ctDNA. Mit diesem Service erhalten Sie ein umfassendes Profil aller Mutationen in den proteinkodierenden Bereichen des Genoms. Dieses Produkt eignet sich für einen ersten Blick auf das Genom eines mutmaßlichen Krebspatienten in Fällen, in denen nur begrenzte Informationen über klinisch relevante Mutationen zur Verfügung stehen.

INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling (591 genes) ist ein umfassendes NGS-Panel zur Charakterisierung wichtiger Krebsmutationen. Mittels Einzelmolekül-PCR zielt dieses Panel auf 50 bekannte Krebsgene einschließlich Tumorsuppressoren, Hotspots und Resistenz-Markern. Hinsichtlich der Sequenzabdeckung und Gleichförmigkeit mit einer Sensitivität von ca. 1 % setzt das Panel einen neuen Standard in der Branche.

INVIEW Liquid Biopsy Oncotarget ermöglicht den ultrasensitiven Nachweis von klinisch relevanten krebsspezifischen Punktmutationen, Insertionen, Deletionen und Genfusionen in zirkulierender Tumor-DNA bis zu einer Allelfrequenz von 0,1 %. Diese Methode eignet sich für die Therapieüberwachung, da sie empfindlich genug ist, um ein Rezidiv in sehr frühem Stadium zu erkennen.

Wie schnell soll ich die Probe nach der Blutentnahme versenden?

Blutproben müssen innerhalb von 24 Stunden nach der Blutentnahme an Eurofins Genomics versandt werden. Die Probe muss in Blutentnahmeröhrchen von BCT Streck gelagert werden. Die Proben können bei Raumtemperatur gelagert und geliefert werden. Plasmaproben müssen auf Trockeneis verschickt werden.

Wie viele Proben kann ich schicken?

Eurofins Genomics nimmt eine beliebige Anzahl von Proben in Vielfachen von vier an.

INVIEW Microbiome Profiling

Allgemeine Fragen zur Probenübermittlung, Bestellung, zum Probenversand und zu Ergebnissen finden Sie hier:

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Welche Spezies können mit Hilfe der Mikrobiom-Analyse auf dem MiSeq detektiert werden?

Es können alle Bakterien, Archaeen und Pilze identifiziert werden, zu denen eine Sequenz in der NCBI Nukleotid Datenbank publiziert ist. Es gibt momentan zum Beispiel tausende bakterielle Spezies mit Sequenz-Einträgen in der Nukleotid Datenbank. Nah verwandte Arten mit fast identischen DNA-Sequenzen können nicht unterschieden werden. In diesen Fällen wird nur der Genus (oder die Familie) bestimmt.

Welche Einschränkungen gibt es bei der Verwendung von NGS für die Mikrobiom-Analyse?

Mikrobiom-Profiling durch Next-Generation-Sequencing (NGS) ermöglicht die Detektion einer Vielzahl von Spezies, darunter:

  • Bakterien: Alle bakteriellen Spezies mit veröffentlichten Sequenzen in der NCBI-Nukleotiddatenbank können identifiziert werden.
  • Archaeen: Archaeenspezies, die in der NCBI-Datenbank vertreten sind, können ebenfalls detektiert werden.
  • Pilze: Pilzarten können durch die Analyse der Internal Transcribed Spacer (ITS)-Regionen oder der 18S-Region identifiziert werden, sofern ihre Sequenzen in der NCBI-Datenbank verfügbar sind.
  • Cyanobakterien: Derzeit ist die Identifizierung von Cyanobakterien aufgrund der Einschränkungen des bestehenden Primer-Setups nicht möglich. Falls Cyanobakterien ein zentraler Fokus Ihrer Studie sind, empfehlen wir die Verwendung alternativer Primer-Sets oder spezifisch entwickelter Methoden zur Amplifikation und Detektion.

Wichtige Hinweise:

  • Auflösungsgrenzen: Nah verwandte Spezies mit nahezu identischen DNA-Sequenzen können möglicherweise nicht unterschieden werden. Die Ergebnisse beziehen sich typischerweise nur auf die Gattung- oder Familienebene.
  • Probenqualität: Die Qualität der DNA und die spezifischen Zielregionen können die Detektionsmöglichkeiten beeinflussen.
  • Datenbankabdeckung: Die Identifizierung von Spezies hängt von der Vollständigkeit und Genauigkeit der Referenzsequenzen in der NCBI-Datenbank ab.

Wie hoch ist der Anteil an falsch positiven oder falsch negativen Ergebnissen?

Falsch-Negative Ergebnisse:

  • Degradierte DNA: Proben mit stark degradierter DNA können dazu führen, dass keine Spezies identifiziert wird, was zu falsch-negativen Ergebnissen führt.
  • Geringe Abundanz: Spezies, die in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden sind (typischerweise unter 0,5 % aller zugeordneten Reads), können möglicherweise nicht erkannt oder gemeldet werden, selbst wenn sie in der Probe vorhanden sind.

Falsch-Positive Ergebnisse:

  • Hohe Sensitivität: NGS detektiert alle erfolgreich amplifizierten DNA-Amplicons. Sequenzen mit niedriger Abundanz oder unerwarteter Länge können aufgrund von PCR- oder Sequenzierungsfehlern fälschlicherweise identifiziert werden.
  • Filterungsprozess: Um falsch-positive Ergebnisse zu minimieren, werden während der Datenanalyse strenge bioinformatische Filter angewendet.

Negative Kontrollen:

Um falsch-positive Ergebnisse weiter zu reduzieren, wird eine negative Kontrolle (steriles Wasser) parallel zu den Proben analysiert.

Können die 16S Primer auch Pflanzenorganellen amplifizieren?


Ja, 16S-Primer können manchmal pflanzliche Organellen amplifizieren, insbesondere das 16S-rRNA-Gen, das in den Chloroplasten von Pflanzen vorkommt. Chloroplasten enthalten eigene ribosomale RNA-Gene, die aufgrund ihres evolutionären Ursprungs Bakterien ähneln.

Der Grad der Amplifikation hängt jedoch von mehreren Faktoren ab:

Primerspezifität:
Einige 16S-Primer sind speziell für bakterielle Ziele entwickelt und amplifizieren möglicherweise Chloroplasten-DNA nicht effizient. Andere könnten breiter anwendbar sein und auch Chloroplasten-DNA einschließen.

Probenzusammensetzung:
In Proben mit einer komplexen Mischung von Organismen, wie z. B. Umweltproben, kann das Vorhandensein von Pflanzen-DNA zur Amplifikation von Chloroplasten-Sequenzen führen.

Zielregion:
Verschiedene Regionen des 16S-Gens weisen unterschiedliche Konservierungsgrade zwischen bakterieller und Chloroplasten-DNA auf, was die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Amplifikation beeinflussen kann.

Empfehlung:
Wenn Sie ausschließlich bakterielle Gemeinschaften analysieren möchten und die Amplifikation pflanzlicher Organellen vermeiden wollen, sollten Sie Primer auswählen, die speziell für bakterielle 16S-rRNA-Gene entwickelt wurden.

Wie sollte ich die Auswahl an Target-Regionen treffen?

Richtlinien zur Auswahl von Zielregionen und Anzahl der Targets für 16S-Mikrobiomanalysen:

Auswahl der Zielregionen:
Für eine umfassende mikrobielle Profilierung wählen Sie mindestens eine Zielregion des 16S-rRNA-Gens. Häufig analysierte Regionen sind V1-V3, V3-V4 oder V3-V5. Die Wahl hängt von Ihren Forschungszielen und den spezifischen interessierenden Taxa ab.

Berücksichtigung mehrerer Zielregionen:
Um die Abdeckung zu maximieren und die Vielfalt Ihrer mikrobiellen Gemeinschaft besser zu erfassen, ist es vorteilhaft, mehrere 16S-Zielregionen zu analysieren. Dies kann helfen, die Einschränkungen einzelner Primer-Sets zu kompensieren, da manche Arten möglicherweise nicht effizient amplifiziert werden.

Literaturrecherche:
Prüfen Sie vorhandene Studien und Literatur zu den von Ihnen gewählten Zielregionen. Dies gibt Einblicke in potenzielle Verzerrungen oder Einschränkungen der verschiedenen Primer-Sets und unterstützt Ihre Auswahl.

Probentyp:
Berücksichtigen Sie die Art Ihrer Proben (z. B. Umwelt-, klinische Proben) und deren erwartete Diversität. Komplexere Proben erfordern möglicherweise eine breitere Auswahl an Zielregionen, um die Gemeinschaftsstruktur präzise widerzuspiegeln.

Experimentelles Design:
Wenn Ihre Analyse darauf abzielt, verschiedene Proben oder Bedingungen zu vergleichen, stellen Sie sicher, dass in allen Proben dieselben Zielregionen verwendet werden. Dies gewährleistet Konsistenz bei der Dateninterpretation.

Welche Qualitätskontrolle führen Sie bei meinen Proben durch?

Qualitätskontrolle bei der Amplicon-Generierung und Sequenzierung

  • Amplicon-Generierung als primäre Eingangskontrolle: Obwohl unsere PCR-Bedingungen optimiert sind, hängt der Erfolg der Amplicon-Generierung stark von der Menge an bakterieller, archaeeller oder pilzlicher DNA in der Probe ab.
  • Qualität der DNA-Extraktion: Wenn wir die DNA extrahieren, wird die Menge der extrahierten DNA mittels Spektrophotometrie bewertet.

Erste Bewertung: Falls kein Amplicon generiert werden kann oder das generierte Amplicon sehr schwach ist, deutet dies stark darauf hin, dass der DNA-Gehalt möglicherweise unzureichend ist.

Negative Kontrollen:

Jede Charge enthält negative Kontrollen (steriles Wasser), um potenzielle Kontaminationen während der Probenvorbereitung zu erkennen.

Qualitätsbewertung der Sequenzierung:

  • Überwachung der Lesequalität: Nach der Sequenzierung wird die Qualität der Reads anhand von Metriken wie Q-Scores bewertet, um potenzielle Probleme mit der Sequenziergenauigkeit zu identifizieren.
  • Filterung von niedrigqualitativen Reads: Niedrigqualitative Reads und Adapter-Sequenzen werden während der bioinformatischen Analyse entfernt, um die Datenqualität zu verbessern.

Was passiert wenn Sie kein oder nur ein sehr schwaches Amplikon generieren können?

Keine Amplicon-Generierung:

Wenn kein Amplicon generiert werden kann, informieren wir Sie und stoppen die Verarbeitung dieser Proben. Für den nicht durchgeführten Sequenzierungsteil wird Ihnen eine Erstattung gewährt.

Schwache Amplicon-Generierung:

Falls nur ein schwaches Amplicon generiert wird, informieren wir Sie ebenfalls. Auf Kundenwunsch kann Eurofins Genomics diese Amplicons dennoch in den Sequenzierungspool aufnehmen. Erfahrungsgemäß resultieren schwache Amplicons jedoch typischerweise in einer sehr geringen Anzahl von Reads. Die Interpretation dieser Reads sollte daher mit Vorsicht erfolgen.

Warum ist die Länge für verschiedene 16S Spezies unterschiedlich?

Genetische Variation:
Verschiedene Spezies weisen unterschiedliche Längen der Zielregionen in ihren Genomen auf. Beispielsweise kann das 16S-rRNA-Gen zwischen bakteriellen Spezies erheblich variieren, was zu Unterschieden in den Amplicon-Längen während der Amplifikation führt.

Intraspezifische Diversität:
Selbst innerhalb einer einzigen Spezies können genetische Variationen, wie Polymorphismen oder Mutationen, Unterschiede in den Amplicon-Längen verursachen.

Gibt es ethische Überlegungen bei der Mikrobiomforschung?

Ja, insbesondere bei menschlichen Proben. Stellen Sie sicher, dass die relevanten ethischen Richtlinien eingehalten werden, und holen Sie die erforderlichen Genehmigungen für Forschungen ein, die menschliche Probanden betreffen.

Welche Probentypen sind für die DNA-Extraktion und das anschließende Mikrobiom-Profiling geeignet?

Häufige Probentypen umfassen Stuhl, Speichel, Hautabstriche, Umweltproben (Boden, Wasser) und mehr. Jeder Probentyp kann spezifische Handhabungsprotokolle erfordern. Bitte konsultieren Sie unseren Leitfaden zur Probeneinreichung für weitere Details.

INVIEW CRISPR Check

Allgemeine Fragen zur Probenübermittlung, Bestellung, zum Probenversand und zu Ergebnissen finden Sie hier:

Allgemeine FAQs im Bereich Next Generation Sequencing >>

Welche Arten von Proben können mit INVIEW CRISPR Check verarbeitet werden?

Als Startmaterial benötigen wir von Ihnen Amplikons, welche die Mutationsstelle überspannen. Das Vorgehen zur Amplikongenerierung hängt von dem Produkttyp ab (Adaptor Ligation oder 2nd PCR Workflow). Instruktionen können Sie auf der Webseite auf dem Tab "Probenvorbereitung" finden. Anforderungen zur Amplikonlänge finden Sie auf dem Tab "Spezifikationen". 

Warum empfehlen Sie eine relativ engen Bereich, innerhalb dem das Wildtyp-Amplikon liegen sollte?

 

Die Amplikonlänge (Wildtyp) muss an die Länge der InDels angepasst werden, die Sie detektieren möchten. Zudem muss die Amplikonlänge ein Merging überlappender Reads zulassen. Üblicherweise sind die Mutationen die Sie mit CRISPR (NHEJ Pathway) einführen im Bereich von 1-20 bp). Um auch größere InDels nicht von der Analyse auszuschließen muss die Wildtyp Amplikongrößer in einem bestimmten Größenbereich liegen.

Sie finden in unserem Sample Preparation Guide die Längenanforderungen für alle Produkttypen und für zwei Beispiel Anwendungsfälle. 

 

Können wir Ihren Service auch nutzen wenn wir mit einem anderen CRISPR System arbeiten als dem SpCas9 System?

Ja, Sie können. In diesem Fall benötigen wir für die Analyse das Schnittstellen Offset (Distanz in Nukleotiden upstream der PAM Sequenz, bei der der Doppelstrangbruch erwartet wird).

 

Haben Sie Empfehlungen für das Assay Setup?

  1. Bitte fügen Sie immer mindestens eine Wildtyp Kontrollprobe in Ihr Experiment ein.
  2. Wenn Sie eine sehr akkurate Bestimmung der Editing Efficiency benötigen, dann empfehlen wir Ihnen Replikate in die Analyse aufzunehmen. Replikate erhöhen die Genauigkeit der Effizienzbestimmung, sind aber nicht zwingend notwendig.

Wie unterscheidet sich INVIEW CRISPR Check NovaSeq und INVIEW CRISPR Check MiSeq?

Beide Produkte sind exzelleente Lösungen um Mutationen zu untersuchen die mit dem CRISPR/Cas System (NHEJ pathway) eingeführt wurden.

The Produkte unterscheiden sich vor allem in der Library Generierung (2-Step Protokoll versus Adaptor Ligations Protokoll) and damit in der Amplikon-Probenvorbereitung. 

Ein Selection Guide ist auf der CRISPR Webseite verfügbar (Tab Overview) um Ihnen zu helfen die beste Lösung für Ihre individuellen Präferenzen und Gegebenheiten zu finden.

Wie sieht der Lieferumfang aus?

  • Umfassender Bericht mit Abschnitten zu Ergebnissen und Methoden
  • Rohdaten als FASTQ Dateien
  • FASTQ Sequenzen nach Qualitäts-Clipping und Merging
  • Gemappte Reads im BAM Format
  • Sequenz des Wildtypallels und alternativer Allele inklusive deren Quantität 
  • Metriken zu Rohdaten, Präprozessierungs-Daten, Mappingergebnisse und Coverage im CSV-Format
  • Berechnete Editing Effizienz pro Probe
Können wir für das Produkt INVIEW CRISPR Check 2nd PCR Amplikonproben einschicken, die aus mehreren verschiedenen Amplikons, generiert mit verschiedenen Primerpaaren bestehen?
Normalerweise würden Sie pro Probe 1 Amplikon senden, das mit 1 Primerpaar erzeugt wurde. In einigen Fällen können jedoch weniger Reads pro Amplikon erforderlich sein, wie in der Projektspezifikation angegeben. In solchen Fällen können die einzelnen Amplikonproben, die Sie senden, auch aus mehreren Amplikons bestehen, die mit verschiedenen Primerpaaren generiert wurden. In diesem Fall werden wir jedoch keine Primersequenzen clippen und Rohdaten versenden.

Oxford Nanopore Sequenzierung

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Welche Art von Dienstleistungen bietet Eurofins für die Oxford Nanopore Instrumente an?

  • Whole Genome Sequenzierung (WGS)
  • Vollängen 16S Sequenzierung
  • Amplikon Sequenzierung
  • Whole plasmid Sequenzierung

Kann ich bereits fragmentierte DNA senden?

Nein, dies wird nicht empfohlen. Optimale Ergebnisse können erzielt werden, wenn die Fragmentierung direkt vor der Bibliotheksvorbereitung durchgeführt wird. Wir empfehlen, unfragmentierte HMW-DNA zu senden, möglichst groß.

Was ist der Unterschied zwischen den ONT Lite-Produkten und den anderen ONT-Produkten?

Unser ONT Lite-Portfolio ist ein hochautomatisierter Hochdurchsatzprozess. Dies ermöglicht schnelle Durchlaufzeiten und günstige Preise.

Unser vollständiges ONT Lite-Portfolio finden Sie hier >>



Neben dem ONT Lite-Portfolio bieten wir äußerst flexible und anpassbare Dienstleistungen auf den GridION- und PromethION-Maschinen von Oxford Nanopore an. Dies reicht von Premium-Ganzgenomsequenzierung (z. B. große bakterielle Genome oder eukaryotische Genome) bis hin zur vollständigen 16S-Mikrobiomprofilierung oder nicht-klonalen / komplexen Amplikon-Sequenzierungsprojekten.

Um mehr über unsere Fähigkeiten zu erfahren, klicken Sie bitte hier >>

Amplikon-Sequenzierung (Long-Read)

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Wann sollte ich den Custom Long-Read Amplicon Sequencing Service anstelle des ONT Lite Clonal Amplicon Sequencing Service verwenden?

Das Custom Long-Read Amplicon Sequencing widmet Ihren Amplicons eine ganze Flow-Zelle. Dadurch ist diese Methode zeitaufwendiger und kostspieliger im Vergleich zum ONT Lite Clonal Amplicon Sequencing Service, aber sie ist in den folgenden Fällen besonders geeignet:

- Wenn Sie zusätzliche Dienste wie 16S Mikrobiom-Analyse, Unique Sequence Analysis, Variant Analysis, Sequence Cleaning, Host Removal oder die Lieferung von Pod5-Rohdaten benötigen.
- Wenn Ihre lineare DNA-Probe nicht klonal ist, sondern eine Mischung verschiedener Moleküle enthält.
- Wenn vollständige, end-to-end Reads ohne Fragmentierung erforderlich sind.
- Wenn eine höhere Anzahl an Sequenzier-Reads benötigt wird, die über das typische Output des ONT Lite Clonal Amplicon Sequencing Service hinausgeht.
- Wenn Sie alle Roh-Reads erhalten möchten, die aus Ihrer Probe generiert wurden.

Wie sollte ich meine Amplicons reinigen?

Wir empfehlen, Ihre Amplicons mit kommerziell erhältlichen Kits auf Basis von DNA-bindenden Beads oder Säulen oder durch enzymatische Reinigung zu reinigen. Bitte schicken Sie keine Primer mit Ihren Proben oder vermischt in Ihren Proben.

 

Welche Arten von Proben können für die Amplicon-Sequenzierung eingereicht werden?

Reichen Sie gereinigte PCR-Produkte mit einer Größe von 500 bp bis 25 kb ein. Die Amplicons sollten idealerweise eine einzelne Bande auf einem Gel erzeugen, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

Führt Eurofins Genomics eine Qualitätskontrolle (QC) an meinen Proben vor der Bibliotheksvorbereitung durch?

Ja, wir führen eine Qualitätskontrolle der Menge der Amplicons durch

Welche Daten- und Dateitypen erhalte ich?

  • Rohdaten der Nanopore-Amplicon-Sequenzierungen (FASTQ) 
  • Rohdaten der Nanopore-Sequenzierungen (POD5) auf Anfrage erhältlich (zusätzliche Kosten) 
  • Kundenspezifische Datenanalyse-Pakete sind in unserem Bestellformular verfügbar
    • Variantenanalyse
      • Varianten (SNPs & InDels) Ergebnisse (TSV)
      • Analysebericht (HTML)
    • 16S-Mikrobiom-Analyse
      • OTU-Quantifizierungstabellen (TSV)
      • Analysebericht (HTML)
    • Analyse einzigartiger Sequenzen
      • Einzigartige Sequenzen (FASTA)
      • Cluster-Quantifizierungstabelle (TSV)
      • Analysebericht (HTML)
    • Konsensus-Sequenzanalyse
      • Konsensus-Sequenz (FASTA)
      • Varianten-Ergebnisse (TSV)
      • Analysebericht (HTML)

Welche Art von Analyse wird für benutzerdefinierte Long-Read-Amplicons angeboten?

Verschiedene Analysen können während der Bestellung ausgewählt werden, darunter 16S-Mikrobiom-Analyse, Konsensus-Sequenzanalyse, Variantendetektion und Identifizierung einzigartiger Sequenzen, je nach den spezifischen Anforderungen Ihres Projekts. Wenn Sie eine spezielle Analyse benötigen, wenden Sie sich bitte an Ihren Vertriebsmitarbeiter.

WGS - kurze Reads (Illumina)

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Wie soll ich meine DNA aufreinigen?

Wir empfehlen die Aufreinigung mit kommerziell erhältlichen Kits - basieren auf DNA-bindenden Beads oder mit Säulen.

Wie berechne ich die benötigte Genom-Abdeckung (Coverage)?

Die Abdeckung wird mit folgender Formel berechnet:  

(Read-Länge) × (Gesamtanzahl der Reads) ÷ (Genom-Größe). 

Zum Beispiel: für die Sequenzierung eines 10Mb großen Genoms mit 20 M Reads bei einem Read-Modus von 2 x 150 bp beträgt die Abdeckung 60x.

Welche Datenausbeute benötige ich?

Abhängig von Ihrer Fragestellung / dem Projekt empfehlen wir folgende Genomabdeckung (Coverage): 

  • Keimbahn- und Analyse der häufigen Varianten: 20-50x 
  • Somatische Mutationen und seltene Varianten: 100-1000x 
  • De novo Assemblierung: 100-1000x  

WGS (ONT)

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Wie soll ich meine DNA aufreinigen?

Wir empfehlen: New England Biolabs Monarch® Spin gDNA Extraction Kit, QIAGEN Genomic-tip-500/G, QIAGEN MagAttract HMW DNA Kit, QIAGEN Puregene Yeast/Bacteria Kit. Im Allgemeinen können alle Extraktionsmethoden verwendet werden, die die Erzeugung von HMW gDNA ermöglichen und die oben genannten Anforderungen erfüllen. Um sicherzustellen, dass HMW DNA extrahiert wird, empfehlen wir:

  • Waschen Sie die Bakterienzellpellets vor der DNA-Extraktion mit PBS, um potenzielle Inhibitoren zu entfernen.
  • Fügen Sie 1 ml PBS hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch Pipettieren.
  • Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwerfen Sie den Überstand.
  • Vermeiden Sie Vortexen und schnelles oder unnötiges Pipettieren; verwenden Sie nur Weithals-Spitzen.
  • Eluieren Sie in nukleasefreiem Elutionspuffer, nicht in Wasser.
  • Vermeiden Sie das Übertrocknen der gDNA.
  • Setzen Sie die DNA nicht hohen Temperaturen (>37°C) für >1 Stunde aus.
  • Verwenden Sie Puffer mit einem geeigneten pH-Wert von 7,5-8,5.
  • Vermeiden Sie interkalierende fluoreszierende Farbstoffe oder UV-Strahlung.
  • Vermeiden Sie Gefrier-Tau-Zyklen; lagern Sie gDNA bei 4°C für 1-2 Monate.

Kurze DNA-Fragmente sind typischerweise nicht ideal für Long-Read-Sequenzierungen, da sie zu einer schlechten Assemblierungsqualität führen können. Wir empfehlen, dass mindestens 50% der DNA länger als 15 kb sind. Um die Sequenzierungsergebnisse zu verbessern, empfehlen wir, kürzere DNA-Fragmente vor der Einreichung aus Ihrer Probe zu entfernen. Ein effektives Protokoll beinhaltet die Verwendung von 4-fach verdünnten SPRISelect-Perlen (35% Volumen/Volumen), um Fragmente kleiner als 3-4 kb zu eliminieren.

Bitte beachten Sie, dass die DNA-Menge nach diesem Prozess abnimmt, daher ist es wichtig, die verbleibende DNA zu quantifizieren, um sicherzustellen, dass genügend Material für die Sequenzierung vorhanden ist.

  • Übertragen Sie jede Probe in ein sauberes 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind-Röhrchen.
  • Verdünnen Sie SPRISelect-Beads mit Elutionspuffer auf 35% (Volumen/Volumen).
  • Resuspendieren Sie die verdünnten SPRISelect-Beads durch Vortexen.
  • Fügen Sie 4-faches Volumen der resuspendierten verdünnten SPRISelect-Beads zu jeder gDNA hinzu und mischen Sie durch Schwenken des Röhrchens.
  • Inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  • Bereiten Sie ausreichend frisches 80% EtOH in nukleasefreiem Wasser für alle Ihre Proben vor.
  • Zentrifugieren Sie die Proben und pelletieren Sie die Perlen auf einem Magneten, bis das Eluat klar und farblos ist. Halten Sie die Röhrchen auf dem Magneten und pipettieren Sie den Überstand ab.
  • Halten Sie das Röhrchen auf dem Magneten und waschen Sie die Beads mit frisch zubereitetem 80% EtOH, ohne das Pellet zu stören. Das EtOH-Volumen muss ausreichen, um die Beads vollständig zu bedecken. Entfernen Sie das EtOH mit einer Pipette und verwerfen Sie es.
  • Wiederholen Sie den vorherigen Schritt.
  • Zentrifugieren Sie kurz und stellen Sie die Röhrchen zurück auf den Magneten, damit die Beads pelletieren. Pipettieren Sie das restliche EtOH ab. Lassen Sie es 30 Sekunden trocknen, aber trocknen Sie die Pellets nicht bis zum Reißen.
  • Entfernen Sie die Röhrchen vom Magnetständer und resuspendieren Sie das Pellet in z.B. 50 µL nukleasefreiem 1xTE oder EB. Zentrifugieren Sie und inkubieren Sie 10 Minuten bei 37°C mit sanfter Agitation (700 U/min) auf einem Schüttler.
  • Pelletieren Sie die Perlen auf einem Magneten, bis das Eluat klar und farblos ist.
  • Entfernen und behalten Sie das Eluat in sauberen 1,5 ml Eppendorf Safe Lock Tubes™.

Alternativ empfehlen wir die DNA-Reinigung und Größenselektion für Long-Read-Sequenzierungen von Jones et al. 2021 (Jones A, Torkel C, Stanley D, Nasim J, Borevitz J, et al. (2021) High-molecular weight DNA extraction, clean-up and size selection for long-read sequencing. PLOS ONE 16(7): e0253830. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0253830; https://www.protocols.io/view/dna-clean-up-and-size-selection-for-long-read-sequ-261ge6ymol47/v4).

 

Reinheit:

Phenol, Chloroform und andere verwandte Reagenzien hemmen die Bibliotheksvorbereitung und müssen vollständig entfernt werden. Obwohl spektrophotometrische Messungen möglicherweise nicht alle Arten von Verunreinigungen erkennen, empfehlen wir dringend, diese durchzuführen, um die Probenreinheit zu bewerten. Idealerweise sollte das 260/280-Verhältnis über 1,8 liegen und das 260/230-Verhältnis zwischen 2,0 und 2,2 liegen. Wenn die Probe kontaminiert ist und diese Metrik nicht erfüllt, extrahieren Sie die Probe entweder erneut oder reinigen Sie die Probe, um die Verunreinigungen mit einem Qiagen-Reinigungskit oder AMPure XP-Perlen zu entfernen. Die Probe darf kein RNA enthalten; wir empfehlen dringend eine RNase-Behandlung während der Extraktion.

  • Darf keine Denaturierungsmittel (Guanidiniumsalze, Phenol usw.) oder Detergenzien (SDS, Triton-X100 usw.) enthalten.
  • Darf keine Restverunreinigungen vom Organismus/Gewebe (Häm, Huminsäure, Polyphenole usw.) enthalten.
  • Darf kein unlösliches Material enthalten oder gefärbt oder trüb sein.

Wie soll ich meine DNA Konzentration und Größe bestimmen?

Quantitative Bewertung

 

Bevorzugte Messmethode: fluoreszenzbasierte Methoden wie Qubit® (Invitrogen, Life Technologies), Quant-iT™ (Invitrogen) oder Quantifluor (Promega).

Wir raten dringend davon ab, Nanodrop zur Quantifizierung von gDNA zu verwenden.

HMW gDNA erfordert oft zusätzlichen Homogenisierungsaufwand (längere Inkubationszeit, erhöhte Inkubationstemperatur, sehr gründliches sanftes Mischen usw.), um eine genaue Quantifizierung zu erhalten. Wenn separate DNA-Quantifizierungen von oben und unten der Probe innerhalb von 15% voneinander liegen, ist dies normalerweise ein gutes Indiz für eine ausreichende Homogenität.

Wenn Sie weniger als die geforderte Menge an gDNA haben, empfehlen wir dringend, zusätzliche Extraktionen durchzuführen, um die Ausbeute zu erhöhen.

 

Qualitative Bewertung

 

Bevorzugte Messmethode: kapillarelektrophoresebasierte Methoden wie Fragment Analyzer oder Bioanalyzer. Hochmolekulare DNA ist größer als 15 kb und zeigt minimale Schmierung. Kontamination, Schäden und Abbau werden durch ein niedrigmolekulares Schmiermuster sichtbar und sollten mit alternativen Reinigungsstrategien wie oben beschrieben entfernt werden.

Kann ich auch schon fragmentierte DNA schicken?

Nein, dies wird nicht empfohlen. Optimale Ergebnisse können erzielt werden, wenn die Fragmentierung direkt vor der Bibliotheksvorbereitung erfolgt. Es wird empfohlen, unfragmentierte HMW-DNA zu senden, so groß wie möglich

Wie viel Sequenzierdaten benötige ich?

Abhängig von Ihrer Fragestellung / dem Projekt empfehlen wir folgende Genomabdeckung (Coverage): 

  • Keimbahn- und Analyse der häufigen Varianten: 20-50x 
  • Somatische Mutationen und seltene Varianten: 100x 
  • De novo Assemblierung: 100x  

Wieviel Daten kann ich erhalten?

Die Datenausbeute hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, z.B. Organismus, Extraktionsmethode, DNA-Qualität, Größe, Handhabung und Lagerung. Daher kann ein erfolgreicher EntryQC keine hohe Sequenzierungsausbeute garantieren, da nicht alle Inhibitoren erkannt werden können.

Pflanzen können insbesondere hohe Mengen an sekundären Metaboliten enthalten, die den Sequenzierungsprozess stören können. Diese Verbindungen können während der Vorverarbeitung schwer zu erkennen und zu entfernen sein, was zu potenziellen Problemen bei der Sequenzierungsausbeute und der Datenqualität führen kann.

Basierend auf unseren Erfahrungen können Sie im Allgemeinen etwa 50-80 Gb Daten pro PromethION-Flow-Cell und ungefähr 6-7 Gb pro GridION-Flow-Cell erwarten. Diese Ausbeuten hängen von Faktoren wie DNA-Qualität und Fragmentlänge ab.

Wie genau sind die Sequenzierungsergebnisse?

Oxford Nanopore selbst gibt für die Flow Cells und Chemie, die wir derzeit nutzen folgende Werte an: Roh-Daten Genauigkeit >Q20 (>99%) und die Konsensus-Genauigkeit ist typischerweise größer als 99.99% .

Siehe auch https://nanoporetech.com/platform/accuracy

Wie sollen die Fehler bewertet werden, die ich einer Homopolymeregion oder an einer Dam- oder Dcm-Methylierungsstelle entdeckt habe?

Die vorherrschenden Fehlermodi beim Oxford Nanopore-Sequenzieren umfassen Deletionen innerhalb von Homopolymer-Bereichen, Fehler, die an der zentralen Position der Dcm-Methylierungsstelle CCTGG oder CCAGG auftreten, sowie Fehler an der Dam-Methylierungsstelle GATC.

Bitte behandeln Sie diese Regionen daher besonders sorgfältig.

Garantieren Sie eine bestimmte Assemblierungsqualität?

Nein, wir können keine Garantien für die Assemblierungsqualität geben. Allerdings wird bei Verwendung von hochwertiger Eingangs-DNA mit kleinen und nicht allzu komplizierten Genomen normalerweise ein einzelnes Contig erzeugt.

Ist es mit ONT möglich den Methylierungsstatus zu bestimmen.

Ja das ist möglich. Bitte sprechen sie uns an.

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