Die passende Antwort auf häufig gestellte Fragen
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Allgemeine Fragen zur Probenübermittlung, Bestellung, zum Probenversand und zu Ergebnissen finden Sie hier:
Was für eine Abdeckung soll ich verwenden?
Zum Auffinden von SNPs in heterozygoten Organismen empfehlen wir mindestens eine 30x-Abdeckung. Eine höhere Abdeckung erhöht die Zuverlässigkeit der SNP-Auffindung. Eine zuverlässige Aufdeckung von genetischen Varianten in inhomogenen Proben wie etwa aus normalen Zellen und Tumorzellen extrahierter DNA erfordert eine höhere Gesamtabdeckung. Die zum Erreichen einer bestimmten Abdeckung auf der interessierenden DNA benötigte Datenmenge ist vom Verhältnis von normaler DNA zu Tumor-DNA abhängig. Bitte beachten Sie, dass auf Grund der unterschiedlichen Effizienz der für die Anreicherung verwendeten Baits die Zielregionen nicht gleichmäßig abgedeckt werden (siehe unten).
Wie handhaben Sie PCR-Duplikate?
Die Häufigkeit von PCR-Duplikaten ist direkt mit Qualität und Menge des Ausgangsmaterials korreliert. Die Library-Erstellung mit weniger als der empfohlenen Menge an DNA erfordert zusätzliche PCR-Zyklen, damit genügend Material zum Beladen des Sequenziergeräts erzeugt wird. Die Häufigkeit von PCR-Duplikaten hängt daher von der Probe ab und kann von GATC Biotech nicht beeinflusst werden.
Duplikate sind aus der Berechnung der durchschnittlichen zielgerichteten Abdeckung nicht ausgeschlossen. Gemäß unserer Erfahrung mit der Sequenzierung humaner Proben erzielen wir für qualitativ hochwertige DNA in der Regel PCR-Duplikatraten von ca. 5 %.
Wenn weitere bioinformatische Analysen (z. B. SNP-Identifizierung) in Auftrag gegeben werden, dann wird nur eine Kopie des doppelten Read-Paares im Alignment behalten. Der Rest wird zur Vermeidung eines Bias aus der weiteren Analyse ausgenommen.
Was für ein Ausgangsmaterial soll ich schicken? In welchen Mengen?
Für optimale Ergebnisse benötigen wir mindestens 100 ng aufgereinigte RNA-freie Doppelstrang-DNA mit hohem Molekulargewicht (Konzentration ≥ 1 ng/µl; OD 260/280 ≥ 1,8; OD 260/230 ≥ 2,0). Für DNA von FFPE-Proben benötigen wir mindestens 200 ng DNA.
Eine Kontamination durch DNA von anderen Spezies (> 3 %, insbesondere von nah verwandten Spezies) könnte die Anreicherung der humanen DNA stören und reduziert zudem die Gesamtmenge an humaner DNA in der gesendeten Probe. Akzeptiert wird in der Regel amplifizierte Gesamtgenom (WGA)-DNA oder DNA aus archiviertem Gewebe, wie beispielsweise Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete (FFPE) Proben. Wenden Sie sich an uns, wenn Sie Einzelheiten wissen möchten.
Was meinen Sie mit überlappenden Reads?
Die Fragmentierung genomischer DNA nach dem Agilent SureSelectXT-Protokoll und die darauffolgende Weiterverarbeitung ergeben eine Normalverteilung von DNA-Fragmenten mit unterschiedlichen Längen. Ein kleiner Prozentsatz der entstandenen Library-Fragmente haben eine Insert-Größe von weniger als 250 bp. Die Sequenzierung dieser Library-Fragmente mit Paired-End-Reads von 150 bp erzeugt teilweise überlappende Reads, welche die gleichen Basen abdecken; somit entsteht eine künstliche Verdoppelung der Abdeckung an diesen Stellen. Zur Gewährleistung präziser Analysen werden diese Basen aus weiteren Analysen (z. B. Erkennung von Einzelnukleotid-Varianten und Insertionen/Deletionen) ausgeschlossen. Darüber hinaus werden die Protokolle bei Eurofins Genomics fortlaufend mit dem Ziel optimiert, die Anzahl an überlappenden Basen auf ein Minimum zu reduzieren.
Wie sieht die Qualität der Daten aus?
Bei der Sequenzierung von humanen Proben im Paired-End-Modus (150 bp) erzielt Eurofins Genomics in der Regel über 80 % Basecalls mit einem Qualitätswert von mehr als Q30 (> 99,9 % Genauigkeit).
Garantieren Sie einen bestimmten zielgenauen Output?
Für Proben, die die erste Qualitätskontrolle bei Eurofins Genomics erfolgreich bestanden haben, garantieren wir Ihnen den Ziel-Output, den Sie bestellt haben. Die durchschnittliche zielgenaue Abdeckung wird berechnet als Summe der kartierten Basen in jeder Zielposition dividiert durch die Anzahl der Basen in der Zielregion (Zielbasen / Größe der Zielregion).
Welche Gene werden angereichert?
Die Zielregion entspricht den Bait-Koordinaten des SureSelectHuman All Exon V6 Kits von Agilent: ca. 60 Mbp der exonischen Basen (> 93 % der Ziele werden mit > 20x, 90 % der Gene werden vollständig abgedeckt – alle Exons – 10 % der Gene werden teilweise abgedeckt).
Werden alle Gene bei 30x abgedeckt?
Auf Grund der unterschiedlichen Effizienz der zur Anreicherung verwendeten Baits (z. B. GC/AT-Gehalt) werden Zielregionen unterschiedlich abgedeckt und die Reichweite und Einheitlichkeit der Abdeckung schwanken innerhalb der Zielregion. Eurofins Genomics wendet das neueste Human All Exon Kit-Design (V6) von Agilent an, das verbesserte Design-Algorithmen aufweist und somit schwierige Regionen besser erfassen und eine hervorragende Einheitlichkeit der Abdeckung bieten kann.