Das CRISPR/Cas9 System ist eine der neuesten Entwicklungen im Werkzeugkasten der Gentechnologie. Mit CRISPR wird es erstmals möglich einfach und kostengünstig Veränderungen direkt im Genom einer Zelle durchzuführen - und das in jedem bisher untersuchten Organismus!
Eurofins Genomics bietet Ihnen ein umfassendes Produktportfolio um Ihr CRISPR/Cas9 Experiment zum Erfolg zu führen.
Cloning Oligos / EXTREmer Oligos
Stellen Sie den sequenzspezifischen Teil Ihrer gRNA durch einfaches Annealing zweier komplementärer Cloning Oligos oder EXTREmer Oligos her.
+ Premium: Annealing der Oligos zu dsDNA und Klonierung.
Gensynthese
Sie benötigen größere dsDNA Konstukte? Wir synthetisieren doppelsträngige DNA um ganze chimäre gRNAs, Donor DNAs oder optimierte Cas9 Enzyme herzustellen.
+ Premium: Subklonierung in den Vektor Ihrer Wahl.
Gen-Fragmente
Ihnen ist die Transfektion mit RNA lieber? Wir synthetisieren Ihr dsDNA-Genfragment als "Promoter:gRNA:Terminator"-Konstrukt zur in-vitro Transkription.
+ Premium: Bereits transkribierte gRNA zur Transfektion.
Custom Sequencing
Überprüfen Sie die Sequenz Ihres CRISPR Plasmids, oder der genomischen Zielsequenz mit einem unserer Sanger Sequenzierservices.
Next Generation Sequencing
Stellen Sie sicher, dass Ihre Wunschmodifikation eingeführt wurde, oder identifizieren Sie off-target Effekte durch Genomsequenzierung.
Im nächsten Tab "Protokoll" stellen wir Ihnen im Detail vor, wie Sie mit unseren Produkten Ihr CRISPR/Cas9-Experiment designen können.
Drei wesentliche Elemente eines CRISPR Systems sind: das Design einer gRNA, die Transfektionsmethode und Kontroll-Sequenzierungen zur Überprüfung des Systems.
Wir bieten Ihnen hier einen Überblick, wie Sie Ihr CRISPR Experiment mit unseren Produkten entwickeln können.
Im nächsten Tab "Hintergrund" finden Sie Informationen zu Funktionsweise des Gene Editings mit CRISPR.
Das CRISPR-System ist ein in Bakterien natürlich vorkommender Mechanismus zur Verteidigung gegen Bakteriophagen. In den letzten Jahren wurde das System gentechnologisch nutzbar gemacht um damit gezielte Veränderungen im Genom einer Zelle einzuführen.
Was wird für CRISPR benötigt?
Für ein funktionelles CRISPR System müssen drei Komponenten berücksichtigt werden:
Genomische Zielsequenz: Innerhalb des Gens, das man verändern möchte, muss ein Sequenzmotiv „NGG“ vorliegen (PAM Motiv). In den 20 bp upstream dieses Motivs wird ein Doppelstrangbruch eingeführt.
guide RNA: Die guide RNA besteht aus zwei strukturellen Teilen, die in einer chimären gRNA zusammengefasst wurden. Der sequenzspezifische Teil ist eine RNA, die 20 bp lang und komplementär zur genomischen Sequenz ist. Dieser Teil variiert je nach Zielsequenz. Der zweite Teil der gRNA ist immer konstant, unabhängig von der Zielsequenz.
Cas9 Enzym: Das Cas9 Protein ist eine RNA geführte Endonuklease. Sobald das Enzym die gRNA gebunden hat, wird es zur genomischen Zielsequenz geleitet und führt innerhalb dieser Zielsequenz einen Doppelstrangbruch ein.
Wie funktioniert CRISPR?
Sobald die drei Komponenten in der Zelle vorliegen, wird das CRISPR System aktiv: Die Cas9 bindet die transkribierte gRNA. Die gRNA führt das Enzym zu der Sequenz im Genom, die komplementär zum sequenzspezifischen Teil der gRNA ist. Sobald die Cas9 am Zielort angekommen, wird die Endonuklease aktiv und führt einen Doppelstrangbruch im Genom der Zelle ein.
Für die Reparatur des Doppelstrangbruchs stehen der Zelle zwei alternative Wege zur Verführung:
Knock-Out durch NHEJ: Die beiden getrennten DNA Sequenzen werden wieder zusammengefügt, wobei dieser Mechanismus fehlerbehaftet ist. Wird beispielsweise 1 bp zusätzlich in die Zielsequenz eingebaut, führt dies zu einer Leserasterverschiebung und damit zu einem inaktiven Protein.
Knock-In durch HDR: Alternativ kann der Zelle zusätzlich eine Donor DNA zur Verfügung gestellt werden, die homolog zu den Sequenzen up- und downstream des Doppelstrangbruchs ist. Hierbei kann der Doppelstrangbruch durch homologe Rekombination mit der Donor DNA repariert werden, wobei die Donor DNA an der Stelle des Doppelstrangbruchs in die genomische Sequenz integriert.
Anwendungen von CRISPR
Durch die Möglichkeit Knock-Outs oder Knock-Ins einzuführen, kann CRISPR für vielfältige Anwendungen der Molekularbiologie eingesetzt werden, wie z.B.:
- Untersuchung von Genfunktionen
- Einführung von Punktmutationen
- Austausch von Genen
- Hinzufügen oder Entfernen von Genen
- Modifikation von regulatorischen Elementen